银杏多肽的提取、分离纯化及体内抗氧化活性研究

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本研究以银杏为主要原料,利用中性蛋白酶与风味蛋白酶分步水解,制备出银杏多肽,再通过不同孔径的过滤膜分离纯化银杏多肽,并且,对不同分子量段的多肽的物性进行研究,通过小鼠体内抗氧化试验检验不同分子量间多肽的抗氧化能力,以及小鼠免疫组织的免疫指数。首先,将银杏粉用中性蛋白酶、风味蛋白酶、碱性蛋白酶、胰蛋白酶及木瓜蛋白酶酶解,确定水解度(DH)最优的蛋白酶,根据水解度的结果,选择中性蛋白酶参加第一步酶解,第二步酶解选用风味蛋白酶。通过单因素试验,研究了第一步酶解过程中温度、底物添加量、初始pH值及酶添加量等因素对水解度的影响。在此基础上,采用四因素三水平正交试验对银杏粉第一步酶解条件进行优化。结果表明,最佳的酶解条件为:底物浓度0.02g/mL、初始pH7.0、反应温度是45℃和中性酶添加量为1.8mg/mL。再通过单因素实验,研究第二步酶解过程中温度,初始pH值,反应时间及风味蛋白酶浓度等因素对水解度的影响。在此基础上,采用四因素三水平正交试验对酶解条件进行优化。结果表明,酶添加量为9.0mg/mL、初始pH7.0、反应温度50℃和反应时间6h,依上述条件进行验证试验所得水解度为25.03%。利用膜分离技术对酶解液分离纯化,首先利用高速离心去除蛋白质和淀粉,再选择分子量分为20、10及2.5kDa的超滤膜进行分离纯化,再使用纳滤膜去除小分子物质,得到不同分子量的肽段,分别为>20、10~20、2.5~10和<2.5kDa的多肽,分别检测多肽液内可溶性蛋白含量为0.69、0.13、3.67和2.74%,而未膜分离的酶解液可溶性蛋白含量为8.76%。物性研究表明10~20kDa的银杏多肽液起泡性最强,酶解液的起泡稳定性最强,2.5~10kDa之间的银杏多肽吸油性最佳。通过小鼠体内评价得知,银杏多肽的体内抗氧化效果普遍优于对照组和Vc灌胃组。分子量<2.5kDa的银杏多肽抗氧化能力极显著,对血液、肝组织、肾组织和心脏组织的T-AOC、GSH-PX及SOD活力有促进作用,提高抑制羟自由基能力和对MDA含量有明显的降低作用;小鼠各组织抗氧化能力与银杏多肽的灌胃剂量成正相关的关系,高剂量的效果明显好于中、低剂量。通过小鼠免疫器官的免疫指数研究看出,分子量<2.5kDa的银杏多肽免疫指数最高,该段多肽具有良好的促进免疫能力。
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