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目的:在前期研究工作的基础上，重新复苏课题组筛选得到的杂交瘤细胞株1H4-A9并腹水诱导制备特异性识别中药重楼活性成分甾体皂苷的单克隆抗体，采用HRP的荧光底物和化学发光底物代替色原底物，建立相应的FEIA和CLEIA检测方法;制备纳米金标记的酶标二抗，建立重楼皂苷的nano-ELISA检测方法。所建立的新型酶联免疫检测方法能够提高检测的灵敏度。 方法: 1、复苏课题组前期筛选出的阳性单克隆杂交瘤细胞株1H4-A9并扩大培养，检测细胞上清分泌抗体状况;小鼠腹腔注射杂交瘤细胞悬液诱生大量MAb，间接ELISA检测腹水效价;分别通过辛酸-硫酸铵和Protein G纯化柱两种方式纯化腹水，SDS-PAGE和间接ELISA分别考察单抗纯度和效价。 2、以TMB作为HRP的新型荧光底物，建立重楼皂苷间接竞争荧光酶联免疫分析(FEIA)方法，建立标准曲线并确定检测限和灵敏度。考察具有较强共轭结构的一些天然产物的热稳定性、空气稳定性及荧光特性，以筛选得到的天然产物作为HRP的荧光底物应用于重楼皂苷的FEIA检测。以鲁米诺作为HRP的化学发光底物，建立重楼皂苷化学发光酶联免疫分析(CLEIA)方法。 3、制备胶体金并考察最优制备方案，通过肉眼观察、UV、粒径仪和透射电镜鉴定胶体金溶液。胶体金标记酶标二抗制备免疫金，考察标记最适K2CO3加入量和最适蛋白浓度，通过UV、粒径仪、试纸条等方法鉴定免疫金。应用免疫金替代原始酶标二抗建立重楼皂苷的新型nano-ELISA检测方法，考察抗原抗体最佳工作浓度、免疫金稀释倍数、作用时间和底物显色时间等优化条件，建立重楼皂苷间接竞争nano-ELISA标准曲线，确定检测限和灵敏度，与重楼皂苷传统ELISA检测方法相对比。 结果: 复苏并扩大培养阳性单克隆杂交瘤细胞株1H4-A9，检测细胞上清分泌抗体效价达到1280以上，腹腔注射杂交瘤细胞悬液，老鼠体内诱导产生腹水，腹水效价达256000以上。采用辛酸-硫酸铵法替代原先的protein G纯化柱纯化腹水，成本低，操作简便，可一次纯化大量腹水，SDS-PAGE结果显示获得的单抗纯度良好，无杂条带，间接ELISA效价达512000以上，效价远高于Protein G柱纯化所得单抗。 以TMB作为新型荧光底物，建立重楼皂苷间接竞争FEIA标准曲线，线性方程为y=60.947x+2905.3，R2=0.9825，对重楼皂苷的最低检测限为0.98 ng/mL，线性范围为250-1 ng/mL，相比于传统ELISA，灵敏度提高了20倍。筛选天然荧光底物，发现了5个对HRP敏感的化合物，分别是阿魏酸、白藜芦醇、葛根素、小檗碱和大黄素，其中白藜芦醇、葛根素和阿魏酸的荧光强度与HRP浓度呈相关性，应用天然荧光底物葛根素检测重楼皂苷腹水效价达32000以上。建立以鲁米诺为化学发光底物的重楼皂苷间接竞争CLEIA检测方法，线性方程为y=-2763.9x+50427，R2=0.9967，线性范围为1000-62.5 ng/mL，最低检测限为31.25ng/mL。 烧制胶体金，通过粒径仪、UV、电镜确定最优烧金方案，考察胶体金标记酶标二抗的最适K2CO3加入量和最适蛋白浓度，应用免疫金替代原始二抗应用于重楼皂苷间接nano-ELISA实验，结果TMB显色效果明显优于传统ELISA。新型问接竞争nano-ELISA方法检测重楼皂苷，考察结果表明，包被抗原浓度为1μg/mL，37℃孵育2h，5％脱脂奶粉封闭液封闭1.5h，单抗稀释比为1∶5000，抗原抗体工作时间为1h，2.5％甲醇-PBS溶液作为样品溶解试剂，免疫金稀释20倍，反应时间为45 min，底物显色12 min后终止显色为检测最优条件，建立的标准曲线为y=8.4244x+1.1645，R2=0.9973，可达到98 pg/mL的检测限，线性范围为100-0.1 ng/mL，相比于传统ELISA，灵敏度提高了200倍。 结论: 本研究成功应用TMB作为荧光底物，建立重楼皂苷荧光酶联FEIA检测方法，使灵敏度相比于传统ELISA提高了20倍，成功筛选出3个天然荧光底物，并选择葛根素应用于重楼皂苷FEIA实验。以鲁米诺为化学发光底物，建立重楼皂苷CLEIA检测方法。考察胶体金最优烧制方案并成功制备免疫金，建立重楼皂苷nano-ELISA检测方法，使检测的灵敏度提高到pg级别，为建立重楼皂苷新型免疫分析技术提供了新思路和新方法。