Mip （macrophage infectivity potentiator,巨噬细胞感染增强子）属于FKBP （FK506binding protein,免疫抑制剂FK506结合蛋白）类型的肽基脯氨酰顺反异构酶（peptidyl-prolyl cis/trans isomerase, PPIase）家族,具有PPIase活性。已经证明,Mip蛋白是一些动物病原微生物（例如嗜肺军团菌、沙眼衣原体、淋球菌等）的重要致病因子。本实验室的研究发现,在十字花科黑腐病菌（Xanthomonas campestris pv.campestris,简称Xcc）中,mip-like基因（以下简称mipXcc）突变导致Xcc胞外蛋白酶活性几乎丧失、胞外多糖（Exopolysaccharide, EPS）产量下降和致病力降低。这说明Xcc的Mip-like蛋白（以下简称MipXcc）在Xcc的胞外蛋白酶和EPS的产生以及致病过程中发挥重要作用,但其作用机理还不清楚。本研究主要探讨MipXcc蛋白影响Xcc的胞外蛋白酶活性的具体作用机制。Xcc8004基因组中注释了6个编码胞外蛋白酶的基因：XC₁514,XC₁515, XC₃376, XC₃377, XC₃378和XC₃379。其中XC₃379（也称为prtA）已被证明是Xcc的主胞外蛋白酶基因,它的突变会导致Xcc丧失95%的胞外蛋白酶活性。为了研究MipXcc蛋白影响胞外蛋白酶活性的分子机制,本研究首先通过半定量RT-PCR检测mapXcc基因突变是否影响prtA的转录,结果显示prtA在mapXcc突变体NK2699和野生型8004中的表达并没有明显差异；在mapXcc突变体中导入组成型表达prtA的质粒也不能恢复其胞外蛋白酶活性。这些结果说明MipXcc不在转录水平调控prtA的表达。Xcc的胞外水解酶是通过Ⅱ型系统分泌到胞外,为了确定mapXcc基因突变是否影响Ⅱ型分泌系统的功能,本研究进行了氯仿熏蒸原位释放周质蛋白的实验,结果显示在mtpXcc突变体细胞的周质空间并没有成熟的蛋白酶存在,之前的研究发现mipXcc基因突变并不影响Xcc胞外纤维素酶和淀粉酶的活性,这说明缺少MipXcc蛋白并不影响Xcc的Ⅱ型分泌系统的功能。PPIase蛋白可以加速多肽的正确折叠,胞外蛋白酶是在周质折叠的,因此推测MipXcc蛋白可能是胞外蛋白酶在周质正确折叠所必需的折叠因子,那么MipXcc蛋白应该存在于周质空间。本研究用Western Blotting对MipXcc蛋白进行了亚细胞定位,结果显示MipXcc蛋白确实位于在Xcc细胞的周质空间。如果MipXcc蛋白是胞外蛋白酶在周质的折叠因子,MipXcc蛋白和胞外蛋白酶应该存在物理上的相互作用。为了证实这一点,本研究采用细菌双杂交系统分别检测了MipXcc蛋白与Xcc编码的六个胞外蛋白酶、一个胞外纤维素酶（XC₀639）、一个胞外淀粉酶（XC₀141）的相互作用情况。细菌双杂交结果显示,MipXcc蛋白与包括PrtA在内的四个胞外丝氨酸蛋白酶有互作。Far-Western分析和免疫共沉淀进一步证实MipXcc蛋白与PrtA在体外以及Xcc体内均能够特异结合。为了证明MipXcc蛋白能够帮助PrtA前体折叠成有活性的成熟蛋白酶,本研究还进行了‘蛋白酶活性拯救实验’,MipXcc蛋白可以在体外帮助PrtA前体变成有活性的蛋白酶,表明胞外蛋白酶PrtA在周质的正确折叠及成熟需要MipXcc蛋白的参与。PrtA是到目前为止第一个被鉴定的Mip蛋白的天然底物（靶标）。典型的Mip蛋白由负责二聚化的N端区域和负责PPIase的C端组成。通过细菌双杂交分析,本研究发现只有C端结构域能够与PrtA产生互作。进一步用带有点突变的MipXcc蛋白进行细菌双杂交分析发现,MipXcc蛋白PPIase区域的五个保守氨基酸（Met192, Ala207, Tyr208, Gly209, Pro218）点突变以后,均丧失与PrtA互作的能力,说明这些氨基酸可能是MipXcc蛋白与PrtA结合必须的。除了PrtA等四个胞外蛋白酶外,Xcc中应该还存在其它MipXcc蛋白互作靶标。本研究采用鸟枪法构建Xcc8004的DNA表达文库,利用细菌双杂交系统筛选MipXcc蛋白的互作靶标。最后从16个测序结果中,得到2个候选靶标：保守假定蛋白XC2962,碱性磷酸酶XC2462。综上所述,本论文的研究弄清了mipXcc突变导致Xcc胞外蛋白酶几乎丧失的原因,是由于主胞外蛋白酶PrtA在周质的正确折叠依赖于MipXcc蛋白,在缺乏MipXcc蛋白的mapXcc突变体中,PrtA前体无法折叠成有活性的成熟蛋白酶。这个结果为全面了解MipXcc蛋白在致病性中的作用提供了线索与思路。