不同碳源诱导粗壮脉纹胞菌CGMCC3088产纤维素酶酶学性质的研究

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采用本实验室自行筛选的新型脉纹胞菌CGMCC3088固态发酵豆渣72h,研究固态发酵物中纤维素酶的提取条件,通过单因素试验发现提取时间、缓冲溶液pH、缓冲溶液体积为影响纤维素酶提取的关键因素。再通过响应面实验,确定了固态发酵物中提取纤维素酶的最优条件为:柠檬酸缓冲溶液(0.1M, pH5.2;1:10w/v),200r/min震荡提取30min,该提取条件下得到粗壮脉纹胞菌纤维素酶总酶活为1.702×10-2IU/mL。利用江西本地产量较大的五种农副产品啤酒糟、豆皮、豆渣、稻草、茶粕为单一碳源,采用粗壮脉纹胞菌固态发酵,探讨不同碳源对粗壮脉纹胞菌发酵产纤维素酶的高峰时间、酶系组分和酶活特性的差异。发现,在啤酒糟培养基发酵48h时滤纸酶(FPA)活力最高,达1.017U/g;在豆皮培养基发酵72h和60h时,外切酶(C1)和内切酶(Cx)酶活力达到最高,分别达到7.156U/g和9.084U/g;在豆渣培养基发酵60h后,β-葡萄糖苷酶(βG)酶活力达到最高,为1.85U/g。啤酒糟培养基酶系组分中的Cx酶活力较低,只有4.069U/g;茶粕和稻草培养基中各酶系组分活力一般,豆渣和豆皮培养基中Cx、C1酶比例合理,两种酶活之间平均相差不到一个酶活单位,FPA酶活力分别达到0.853U/g和0.921U/g。研究发现:对纤维素含量较多而木质素含量较少的农副产品,例如豆皮培养基(纤维素37.77%,木质素2.66%)粗壮脉纹胞菌生长较好,所产纤维素酶酶活性较高,并且根据五种基料中纤维的降解结果,发现粗糙脉纹孢菌所产纤维素酶系对于纤维素的降解效率比对半纤维素和木质素的降解效率要高。采用X-衍射仪和扫描隧道电子显微镜分别对未处理和已发酵的农副产品进行结晶度和表面结构的检测,以进一步验证不同农副产品对诱导粗壮脉纹胞菌产纤维素酶能力的差异。根据X-衍射图谱,可以发现:所有农副产品在经过发酵后,在纤维素结晶区的主吸收角度下,吸收强度都有所下降且无定形区的衍射峰都趋于平缓。经计算得知啤酒糟、稻草、茶粕、豆渣和豆皮中纤维素的结晶度(Segal method)分别为47.5、75、53.13、43.2和61.2,而经粗壮脉纹胞菌固态发酵后,他们的结晶度明显降低,分别为:42、60.5、41.18、36.67和43.28,对豆皮和茶粕中纤维结晶区的降解最明显。电子显微镜图显示经过48h发酵后豆皮发酵物表面呈现凹凸程度较大,72h后内部纤维管鞘出现明显断裂,稻草发酵物表面结构较严密,发酵72h后仅出现部分螺纹状凹陷,而其他实验组均有不同程度的纤维破裂情况。结合以上实验现象,最终判断豆皮作为单一碳源对于粗壮脉纹胞菌固态发酵产纤维素酶的诱导效果最佳。为了排除各农副产品在发酵初始时,由于营养成分差异导致产酶结果变化,故选取两种典型纤维素组分的农副产品:稻草和豆皮,稻草半纤维素和木质素较多而豆皮纤维素含量较多。在发酵起始阶段向两种基料中均加入2g葡萄糖和10g蛋白胨,纤维素酶产酶高峰期提前至48-60h,豆皮和稻草高营养培养基中C1酶活分别上升41.76%、60.38%,Cx酶活上升68.06%、60.1%;但豆皮高营养培养基所产各纤维素酶组分的酶活力均比稻草高营养培养基高,无纤维素碳源对照组各纤维素酶组分活力均很低,说明在有充足营养成分满足菌体生长的前提下,没有纤维类碳源,粗壮脉纹胞菌同样是无法高效产纤维素酶的,结合稻草和豆皮高营养组实验,我们可以推断纤维素是诱导粗壮脉纹胞菌产酶的直接诱导物。本文采用粗壮脉纹胞菌分别与东方伊莎酵母、乳酸杆菌、里氏木霉、绿色木霉复配对茶粕进行固态发酵,探讨粗壮脉纹胞菌与不同种类微生物复配产纤维素酶的效果。发现粗壮脉纹胞菌和绿色木霉复合发酵后的C1酶酶活力较粗壮脉纹胞菌单菌发酵提高了51.09%,粗壮脉纹胞菌和绿色木霉复合发酵其纤维素酶分泌的周期得到延长,96h时C1酶和Cx酶的活力分别达到16.668U/g和15.548U/g均超过同时期粗壮脉纹胞菌单菌发酵的酶活力11.045U/g和15.111U/g;粗壮脉纹胞菌复合里氏木霉、绿色木霉混合发酵组对茶粕粗纤维的最终降解率分别达到了64.19%和61.59%。而和乳酸杆菌、酵母菌复合发酵96h后所有纤维素酶组分的酶活较高峰时期均下降60%以上,对茶粕粗纤维的最终降解率也只有34.92%和41.89%,呈现拮抗作用。不论是单菌还是复合菌发酵,接种量的提升总体上会导致酶活力的增加。
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