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背景与目的:n-3多不饱和脂肪酸(n-3 polyunsaturated fatty acids,n-3 PUFAs)尤其是二十二碳六烯酸(DHA)对于脑发育和功能的正常发挥至关重要。孕后期至生后1~2岁是脑聚集DHA的高峰时期,妊娠期及哺乳期母体需摄入足量的DHA以确保胎儿及婴幼儿脑的正常发育所需。随着膳食结构与饮食模式的转变,目前许多国家育龄期妇女DHA摄入量远达不到WHO的推荐摄入量(至少200mgDHA/天)。孕期及哺乳期n-3 PUFAs缺乏不仅影响发育期的脑结构,引发学习、认知行为的改变,还会增加子代成年期焦虑、抑郁症等神经精神类疾病的发生风险,但是有关n-3 PUFAs缺乏对脑功能远期影响的具体机制仍不十分清楚。前期,我们利用n-3 PUFAs缺乏及四种不同n-3 PUFAs含量的饲料(n-3 PUFAs供能百分比分别为0.41%、0.92%、2.50%和3.84%;n-6/n-3 PUFAs比值分别为15.7:1、6.3:1、1.6:1和1:5.7)喂养孕期及哺乳期母鼠,观测其对子代幼鼠(生后7 d)脑神经增殖分化和凋亡的影响。结果发现足量但不过量的n-3 PUFAs,即n-6/n-3 PUFAs在6.3:1~1.6:1之间能更好地促进脑发育。在此研究基础上,我们继续观测孕期及哺乳期n-3 PUFAs喂养状况-n-3 PUFAs缺乏和n-3 PUFAs足量(n-6/n-3 PUFAs为6.3:1)对子代成年期小鼠脑神经增殖分化及凋亡的影响,并以脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,bdnf)为例,从表观遗传学途径探讨孕期及哺乳期n-3 PUFAs喂养状况对子代成年期脑功能影响的调控机制。方法:使用3-4周龄清洁级C57BL/6J雌性小鼠,随机分为两组(10只/组),分别给予n-3 PUFAs缺乏和n-3 PUFAs饲料(n-6/n-3 PUFAs比值为6.3:1)喂养。雌性小鼠喂养至12-14周龄时,与正常饲料喂养的雄性小鼠合笼交配繁殖。在仔鼠生后21天断乳时,随机挑选20只n-3 PUFAs缺乏组的雄性仔鼠用含n-3 PUFAs饲料喂养,选择等量n-3pufas饲料组雄性仔鼠改用n-3pufas缺乏饲料喂养;剩余雄性仔鼠(20只/组)继续用与母鼠相同饲料持续喂养至3月龄实验结束。小鼠过量麻醉牺牲后取脑(7-9只/组),采用脂肪酸甲酯化-气相色谱分析对脑脂肪酸构成进行测定;采用免疫组织化学技术对海马神经增殖/分化标志物-钙视网膜结合蛋白(calretinin,cr)、抗凋亡蛋白-b淋巴细胞瘤-2蛋白(b-celllymphoma-2,bcl-2)及致凋亡蛋白-bcl-2相关x蛋白(bcl-2associatedxprotein,bax)的表达进行分析;同时应用实时荧光定量pcr技术测定脑皮层bdnf基因不同剪接体(ii、iv、vi、ix)mrna的表达;选取mrna表达受孕期及哺乳期n-3pufas喂养状况影响的bdnf剪切体(iv和ix),进而应用亚硫酸盐修饰直接测序法检测仔鼠大脑皮层这两个剪切体各自启动子区的dna甲基化水平。结果:1.孕期和哺乳期n-3pufas喂养状态对成年期仔鼠脑脂肪酸构成的影响与n-3pufas缺乏饲料持续喂养组仔鼠相比,孕期和哺乳期n-3pufas缺乏而断乳后给予含n-3pufas饲料喂养的仔鼠成年后脑组织dha及总n-3pufas含量显著增加,可达到n-3pufas饲料持续喂养仔鼠的浓度,同时花生四烯酸(aa)及总n-6pufas含量降低。孕期和哺乳期n-3pufas饲料喂养而断乳后给予n-3pufas缺乏饲料喂养的仔鼠,成年后脑组织dha和总n-3pufas含量较n-3pufas饲料持续喂养仔鼠的含量明显降低,但仍高于n-3pufas缺乏饲料持续喂养组仔鼠的含量。2.孕期及哺乳期n-3pufas喂养状态对海马ca3区cr、bcl-2和bax表达的影响与n-3pufas缺乏饲料持续喂养仔鼠相比,孕期和哺乳期n-3pufas缺乏而断乳后给予含n-3pufas饲料喂养仔鼠成年后海马ca3区cr阳性细胞od和na值均未见明显变化(p>0.05),仍低于n-3pufas饲料持续喂养仔鼠(p<0.05)。与n-3pufas饲料持续喂养仔鼠相比,孕期和哺乳期n-3pufas饲料喂养而断乳后给予n-3pufas缺乏饲料喂养的仔鼠,成年后海马ca3区cr阳性细胞od和na值并未降低(p>0.05),na仍显著高于n-3pufas缺乏饲料持续喂养仔鼠的水平(p<0.05)。与n-3pufas缺乏饲料持续喂养仔鼠相比,孕期和哺乳期n-3pufas缺乏而断乳后给予含n-3pufas饲料喂养仔鼠成年后海马ca3区bcl-2阳性细胞od和na均未见明显变化(p>0.05),仍低于n-3pufas饲料持续喂养仔鼠(p<0.05)。与n-3pufas饲料持续喂养仔鼠相比,孕期和哺乳期n-3pufas饲料喂养而断乳后给予n-3pufas缺乏饲料喂养的仔鼠,成年后海马ca3区bcl-2阳性细胞od和na值并未降低(p>0.05),仍显著高于n-3pufas缺乏饲料持续喂养仔鼠的水平(p<0.05)。各组间海马ca3区bax阳性细胞od和na值均无明显差异(p>0.05)。3.孕期和哺乳期n-3pufas喂养状态对成年期仔鼠脑皮质bdnf剪接体(ii、iv、vi、ix)mrna表达的影响与n-3pufas缺乏饲料持续喂养仔鼠相比,孕期和哺乳期n-3pufas缺乏而断乳后给予含n-3pufas饲料喂养仔鼠成年后脑组织bdnfiv的mrna表达未见明显变化。与n-3pufas饲料持续喂养仔鼠相比,孕期和哺乳期n-3pufas饲料喂养而断乳后给予n-3pufas缺乏饲料喂养的仔鼠,bdnfiv的mrna表达没有降低,仍高于n-3pufas缺乏饲料持续喂养的仔鼠。与n-3pufas缺乏饲料持续喂养组仔鼠相比,孕期和哺乳期n-3pufas缺乏而断乳后给予含n-3pufas饲料喂养的仔鼠成年后脑皮质中bdnfix的mrna表达明显升高,但仍低于持续n-3pufas饲料喂养的仔鼠;与n-3pufas饲料持续喂养仔鼠相比,孕期和哺乳期n-3pufas饲料喂养而断乳后给予n-3pufas缺乏饲料喂养的仔鼠,bdnfix的mrna表达并未降低,仍高于n-3pufas缺乏饲料持续喂养的仔鼠。bdnfii、bdnfvi的mrna表达在各组间均无明显变化。4.孕期和哺乳期n-3pufas喂养状态对成年期仔鼠bdnf基因iv、ix启动子区cg位点甲基化的影响由结果3可知,bdnf IV和IX的mRNA表达受孕期及哺乳期n-3 PUFAs喂养状况的影响,进而对bdnf IV启动子区的13个CG位点和bdnf IX启动子区的6个CG位点甲基化水平进行测定。发现与n-3 PUFAs缺乏饲料持续喂养组仔鼠相比,n-3 PUFAs饲料持续喂养组仔鼠,bdnf IV启动子区的第4、5、7、9号CG位点和bdnf IX启动子区的1号、4号CG位点的甲基化水平有所降低。与n-3 PUFAs缺乏饲料持续喂养组仔鼠相比,孕期及哺乳期n-3 PUFAs缺乏的仔鼠在断乳后给予含n-3 PUFAs饲料喂养,除bdnf IV启动子区的9号CG位点的甲基化水平明显降低外,bdnf IV和IX启动子区的其他CG位点甲基化水平均未发生变化;同样,与n-3 PUFAs饲料持续喂养组仔鼠相比,孕期和哺乳期n-3 PUFAs饲料喂养而断乳后给予n-3 PUFAs缺乏饲料喂养的仔鼠,bdnf IV和IX启动子区各CG位点的甲基化水平未见明显改变。结论孕期和哺乳期保证适量的n-3 PUFAs摄入,不仅有助于成年期脑神经元的发生,减少神经元凋亡,而且能够维持成年期脑功能相关基因bdnf的正常表达,其影响机制可能与基因启动子区的DNA甲基化改变有关。