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几丁质酶在生物防治、生物质转化以及几丁寡糖制备等领域有重要的应用价值。本论文主要对猪粪便宏基因组、嗜热拟青霉和米黑根毛霉来源的几丁质酶基因进行克隆、表达、性质及应用研究,论文主要结果如下:(1)从猪粪便宏基因组中克隆得到一个新的糖苷水解酶第18(GH 18)家族几丁质酶基因(Echi47),Echi47全长 1,161 bp,编码386个氨基酸。Echi47成功在E.coli BL21(DE3)以及毕赤酵母中表达。其最适温度40℃,最适pH 5.0。以胶体几丁质为底物时该酶比酶活为6.84 U/mg。Echi47为外切型几丁质酶。该几丁质酶在毕赤酵母高密度发酵培养180 h后,细胞湿重达到407g/L,蛋白含量为7.9g/L,发酵液上清酶活力为35.8U/mL。该酶对胃蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶K和风味蛋白酶有良好抗性。几丁质酶Echi47在胰蛋白酶、风味蛋白酶和蛋白酶K中很稳定,处理60 min后剩余80%以上的相对活性。在模拟消化道环境中,Echi47从80 mg的胶体几丁质中水解释放21.1 mg的几丁寡糖产物。(2)从嗜热拟青霉J18中克隆得到一个新的GH18家族几丁质酶基因(Ptchi45),全长1639 bp,包含6个内含子,cDNA全长1275 bp,编码424个氨基酸和一个终止密码子。Ptchi45成功在毕赤酵母中表达。该酶最适温度50℃,最适pH 3.5。以胶体几丁质为底物时该酶比酶活为16.1 U mg-1。胶体几丁质水解的初始阶段产物全部为几丁二糖,没有几丁三糖和单糖产生。因此判断该几丁质酶应该为外切型几丁质酶。高密度发酵培养180 h后,细胞湿重达到392g/L,蛋白含量为8.8g/L,发酵液上清酶活力达到126.4U/mL。(3)从米黑根毛霉CAU432中克隆得到新的GH 18家族几丁质酶基因(Rmchi48),该基因全长1849bp,包含7个内含子,cDNA全长1338bp,编码445个氨基酸,蛋白分子量为48 kDa。Rmchi48成功在E.coli中得到表达。根据Rmchi48的晶体结构构建了 loop结构(Rchi48-loop)和二硫键(Rchi48-C192/C349)缺失突变体,也成功的在E.coli中得到表达。Rmchi48、Rchi48-loop 和 Rchi48-C192/C349 的最适 pH 分别为 5.0、6.0 和 5.5。Rmchi48 及突变体最适温度均为40℃。Rmchi48经60℃处理30 min后酶活力很快降低。Rchi48-loop和 Rchi48-C192/C349 在 50℃ 和 60℃ 处理 30 min 后酶活力很快降低。Rmchi48、Rchi48-loop、Rchi48-C192/C349对于胶体几丁质、壳寡糖和乙二醇几丁质都具有水解活性。Rmchi48以壳寡糖为最适底物,当缺失突变后胶体几丁质为最适底物。Rmchi48水解胶体几丁质产物中GlcNAc,(GlcNAc)2,(GlcNAc)3 分别占 6.39%,74.01%,19.60%。Rmchi48 水解壳聚糖产物中 GlcN,(GlcN)2,(GlcN)3 分别占 15.33%,72.18%,12.49%。40℃ 时,Rmchi48 半衰期为462.2min,Rchi48-loop半衰期为211.7min,Rchi48-C192/C349半衰期为214.2min。而50℃ 条件下,Rmchi48 半衰期为 Rchi48-loop 和 Rchi48-C192/C349 的 4.8 倍和 5.2 倍。在60℃ 条件下,Rmchi48 半衰期分别为 Rchi48-loop 和 Rchi48-C192/C349 的 1.8 倍和 1.7 倍。