哈氏噬纤维菌（Cytophaga hutchinsonii）是一种可以高效快速降解纤维素的革兰氏阴性菌,但其对纤维素独特的降解机制仍是未解之谜。近几年,随着对C hutchinsonii.研究的不断深入,许多与纤维素降解相关的基因功能逐渐清楚,其独特的纤维素降解机制逐渐被揭示。因此进一步研究C.hutchinsonii的纤维素降解相关基因,更有助于揭示C.hutchinsonii的纤维素降解机制。在C.hutchiinsoni中蛋白 CHU₃237 具有 Peptidase fami1y C25 结构域,而且预测是P.gingivalis T9SS中C端信号肽酶PorU的同源蛋白。实验室之前的研究表明,对基因chu 3237进行无痕敲除后,突变株A3237的纤维素利用和滑动能力都出现了部分缺陷,而且胞外蛋白大量减少,其中很多被预测是T9SS的底物蛋白,所以推测CHU₃237在C.hutchinsonii中也作为切割CTD的肽酶行使功能。为了进一步验证CHU₃237的功能,本论文对其可能的蛋白酶的功能位点进行突变,研究了突变株的各种性质。除此之外,还对其他可能参与纤维素降解的基因功能进行了研究。前期通过转座子突变筛选到可能影响纤维素降解的基因chu_gld1、chu_gld2和chu_ion1,本论文通过同源双交换的方法对其进行了基因敲除,研究其缺失菌株对纤维素降解的影响。具体研究内容和结果如下:1.CHU₃237功能的研究通过查阅文献和生物信息学分析推测CHU₃237的酶活位点是第803位组氨酸和第837位半胱氨酸,对CHU₃237蛋白的两个功能位点进行原位单突变和双突变,得到突变株H803A、C837A、H803A&C837A。发现突变株H803A、C837A、H803A&C837A的滤纸降解能力和琼脂平板扩散能力均出现明显下降,而且细胞表面纤维素酶酶活也出现明显下降,同时胞外蛋白分泌明显减少,其中胞外主要的分泌蛋白CHU₀344在胞外蛋白的含量大量减少。进一步对通过T9SS分泌的细胞表面纤维素酶CHU₀778、CHU₁336的定位情况进行研究,western blot的结果表明CHU₀778、CHU₁336在分泌过程中可能存在蛋白修饰,而CHU 3237的缺失影响了 CHU₀778、CHU₁336在外膜的成熟和定位。这些结果说明CHU₃237的缺失影响了Chutchininsoi细胞表面蛋白和胞外蛋白的分泌的成熟和定位,进而影响了C.hutchinsonii的纤维素降解和滑动。我们进一步检测了突变株中CHU₃237的转录和表达情况,结果显示点突变的CHU₃237可以进行正常转录和表达。这些结果说明,CHU₃237的第803位氨基酸和第837位氨基酸对CHU₃237功能行使是必须的,CHU₃237可能具有蛋白酶的活性。我们通过添加His-Tag标签将CHU₃237在大肠杆菌中进行了异源表达,并尝试进行体外酶活检测,但是由于蛋白表达量非常有限,没有检测到体外活性。2.chu_gld1、chu_gld2和chu_ion1基因功能的初步研究对可能参与纤维素降解相关基因chu_gld1、chu_gld2和chu ion1逐一进行了基因敲除,chu_gld1、chu_gld2和chu_ion1缺失后突变株对纤维素的利用均出现不同程度的延迟,表明chu_gld1、chu_gld2和chu_ion1的缺失造成C.hutchinsonii.的纤维素降解能力的下降,但并没有完全丧失降解纤维素的能力。进一步研究表明各基因的突变并没有直接影响细胞的纤维素酶活力和对结晶纤维素的吸附能力,其影响纤维素降解的机制还有待进一步探索。chu_gld1、chu_gld2对纤维素利用的影响可能与其影响菌体运动有关,进一步研究chu_gld1、chu_gld2影响菌体滑动的机制,将有助于揭示哈氏菌滑动能力与纤维素降解的关系。