目的及意义异基因造血干细胞移植(allo-SCT)是目前能够根治多种造血系统良恶性疾病及部分实体瘤的重要及有效的手段之一。然而,移植后的并发症复发排斥及移植物抗宿主病(GVHD)都极大地影响了移植的临床治疗效果。有研究发现精确动态监测移植后患者的供者细胞嵌合率(DC)可以早期预测GVHD或排斥复发,所以移植后检测DC对于判断移植物状态及决定下一步治疗方案非常重要。嵌合率的检测经典方法有：(1)血型；(2)红细胞同工酶；(3)性染色体核型分析；(4)HLA抗原；(5)限制性长度多态性；(6)可变串联重复序列VNTR；(7)微卫星重复序列STR等。大部分病例可用上述方法得到客观的植入证明,但都存在其固有缺点。本研究的第一部分通过实时定量PCR(RQ-PCR)技术对供受者差异单核苷酸多态性(SNP)位点进行检测,建立了一种目前国内未曾报道的定量检测嵌合体的方法,以达到经济、简便、精确的目的；第二部分重点分析了移植后早期(+7d、+14d)CD4+T细胞、自然杀伤(NK)细胞以及T调节细胞(Treg cell)供者嵌合率与临床结局关系,尤其是+7d嵌合率,希望在患者达到完全嵌合(CC)或在出现临床早期事件之前找到一些预测指标,来指导预后、提前干预。第一部分SNP-PCR定量检测异基因移植后嵌合率方法的建立方法1.收集2007年4月至2009年12月长海医院65例行异基因移植的移植前供受者及移植后患者+7d、+14d、+21d、+30d、+60d、+90d、+6m、+1年、+2年等的EDTA抗凝外周血或骨髓标本共650份；2.按试剂盒盐析法或采用DNAzol或Chelex-100试剂提取基因组DNA,分光光度计测取DNA纯度,-20℃冻存备用；3.选取了9条不同染色体上共18个SNP位点作为备选差异SNP位点,通过定量PCR筛选出供受差异SNP位点；4.RQ-PCR扩增筛选出的供受差异SNP位点,基因GAPDH校正误差,5个浓度梯度GAPDH质粒建立标准曲线,最后通过公式计算出供者嵌合率(DC)；5.通过对已知嵌合比例的模拟嵌合标本进行嵌合率检测,以及同时进行XY-FISH、STR-PCR及特殊融合基因检测来验证方法的准确性及敏感度；6.统计学处理：利用SPSS11.0软件进行统计学分析,数据以均数±标准差表示,相关性检验用直线回归分析,批间差及批内差采用单样本t检验,检验水准α=0.05。结果1.标准品扩增的17次标准曲线,平均斜率为-3.39(-3.22～3.65),平均截距为39.97(37.33～43.19),相关系数均大于0.995, RQ-PCR反应体系的扩增效率接近理想水平,实验结果可信；批间差为1.1%,批内差为0.50%,均在可控范围；2.内参GAPDH及各SNP位点所构建的质粒扩增效率基本一致,所以最后仅利用内参一条标准曲线来计算两者的拷贝数；3.95.4%移植前供受者经定量PCR反应后均能找到相互差异的位点。其中阳性率较高的位点有S2、S7b、S10b、Sgst等；4.与模拟混合嵌合相关系数在0.99以上,可重复敏感度可达0.01%,与FISH、STR-PCR结果相比,差异均没有统计学意义,并且与特定白血病融合基因结果比较,供者型100%CC标本,融合基因结果均为0%,相反MC标本,融合基因均为阳性,且同一患者供者细胞的比例越少,融合基因的表达率越高。第二部分异基因移植后早期(+7d、+14d)免疫细胞供者嵌合率的预后意义方法1.收集的标本同前,收集此65名移植患者的一般信息,包括性别、年龄、疾病种类、疾病状态、移植前化疗次数、移植物来源、HLA配型、预处理强度、血型、外周血植入速度、移植后并发症、结局、存活时间；提取基因组DNA(方法同第一部分),-20℃冻存备用；2.采用SNP-PCR方法(同第一部分)对650份标本进行嵌合率检测,分析+7d、+14d嵌合率与移植并发症及结局的关系；3.收集2008年7月至2009年9月长海医院32例异基因移植后+14d、+30d、+60d、+90d、+6m、+1年等的EDTA抗凝骨髓标本共150份,收集患者的一般信息(具体内容同上)；4.免疫磁珠法分选CD3+、CD56+、CD4+CD25+细胞亚群,提取基因组DNA,-20℃冻存备用；3. SNP-PCR对标本行嵌合率检测(方法同第一部分),分析+14d各细胞亚群的嵌合率与移植并发症及结局的关系；5.采用SPSS11.0统计分析软件包进行数据的统计分析,数据以均数±标准差表示,两组计数资料用Fish精确概率法分析,计量资料采取t检验,生存分析采用Kaplan-Meier方法,检验水准α=0.05。结果1.无论清髓性还是减低剂量移植,患者均能很好耐受,在65例患者中,2例未植入,2例移植物被排斥,余均顺利植入；2.中性粒细胞平均恢复时间(NRT)以及血小板平均恢复时间(PRT)分别为14天及16天；NRT(PRT)>14天患者的+7d平均嵌合率要低于NRT(PRT)<14d患者,分别是69.6%vs 77.3%以及69.5%vs 78.4%,但差异没有统计学意义(P>0.05)；+7天嵌合率<65%组与>65%组的平均白细胞、血红蛋白以及血小板计数均没有显著差别,分别是0.38±0.75 vs 0.33±0.65×109/L(P=0.819),83.6±11.8 vs 77.4±17.8g/l(P=0.207)以及22.9±26.9 vs 25.5±37.6x 109/L(]P=0.801),+7d嵌合率水平与外周血象的高低无直接联系；3.在65例患者中,13例复发,复发患者的+7d及+14d平均嵌合率均明显低于非复发患者,分别为51.86%vs 83.02%及82.89%vs 95.37%(P<0.01)；共24例患者发生GVHD,包括14例aGVHD及13例cGVHD(10例局限型和3例广泛型),ⅡtoⅣ级aGVHD共有8例；4.随着+7d嵌合率逐渐增加,复发率逐渐降低(P=0.0001)、GVHD发生率逐渐升高(P=0.001),髓外复发差异不明显；+7d嵌合率<65%组的复发或排斥率显著高于>65%组,为68.8%vs 8.7%(P=0.0001)；+7d嵌合率>85%组GVHD(包括总GVHD及cGVHD)的发生率明显高于<85%组,为46.43% vs 9.52%(P<0.01), aGVHD在两组之间的差异无统计学意义(P=0.091)；5.随着+14d嵌合率水平的逐渐增加,复发率亦逐渐降低(P=0.002),而GVHD发生率上升趋势不明显(P>0.05)；但进一步将嵌合率按85%及95%分组后,>85%组复发率显著降低(P<0.01),>95%组总GVHD及cGVHD的发生率明显升高(P<0.01)；6.共有21名患者在随访的两年半中死亡,24个月总体生存率(OS)为56%,+7d嵌合率在65-85%的这组患者OS明显高于<65%及>85%组,分别是82.6%vs.47.0%(P=0.04),我们将其定义为+7d的“最佳生存区间”。+14d嵌合率85-95%的区间并没有得到同样的结论(P>0.05)。7.+7d嵌合率在65-85%之间与区间之外的患者相比,疾病类型、移植前化疗次数、疾病状态、移植物类型、年龄、HLA配型、血型、干细胞来源均没有显著差别(P>0.05)。8.32例患者T、NK细胞亚群均分选成功,纯度在75-95%之间；在32例拟分选CD4+CD25+细胞亚群的患者中,2例无差异位点,2例未采集标本,3例分选失败,最后成功的有25例,成功率89.3%,纯度在70-80%之间；9.+14d T细胞嵌合率<80%易于复发,40%vs 4.5%(P=0.024),但其比例与GVHD的发生尚无统计学联系；+14d NK细胞的嵌合率与复发及GVHD的发生关系并不密切(P>0.05)；10.+14dCD4+CD25+嵌合率的比例与排斥复发及GVHD的关系无统计学意义(P>0.05),但其与+14d CD4+T细胞嵌合率的差值是否大于零与GVHD的发生有密切联系,如果+14dCD4+CD25+嵌合率高于CD4+T细胞,则不易发生GVHD,反之则GVHD发生明显升高GVHD发生率分别是6.7%vs 50%(P=0.014)。结论1.SNP-PCR方法检测嵌合率方便、准确、可靠,95.4%移植前供受者经定量PCR反应后均能找到相互差异的位点,适宜在中国人群推广应用；与模拟混合嵌合相关系数在0.99以上,可重复敏感度可达0.01%,与FISH、STR-PCR结果相比,差异均没有统计学意义,与特殊融合基因结果相符；2.NRT>14天患者的+7d平均嵌合率要低于NRT<14d患者,但差异没有统计学意义,PRT同样如此；+7天嵌合率<65%组与>65%组的平均白细胞、血红蛋白以及血小板计数均没有显著差别；+7d供体嵌合率水平与外周血象的高低无直接联系；3.在较强预处理作用下,移植后+7d平均嵌合率即达到76.36%,+14d达到CC的患者>50%,植入速度明显快于报道的非清髓移植(NST)；供体T细胞植入相对缓慢,明显慢于NK细胞；4.随着+7d及+14d嵌合率增加,复发率逐渐降低、GVHD发生率逐渐升高；+7d嵌合率<65%组复发或排斥率显著高于>65%组；>85%组GVHD发生率明显高于<85%组；将+14d嵌合率按85%及95%分组后,>85%组复发率显著降低,>95%组总GVHD及cGVHD的发生率明显升高；+7d嵌合率<65%及+14d<85%可以作为排斥或复发的预警标志,+7d嵌合率>85%及+14d>95%可以作为GVHD发生的预警标志；5.+14d T细胞嵌合率<80%易于复发(P=0.024),但其比例与GVHD的发生尚无统计学联系；+14d NK细胞的嵌合率与复发及GVHD的发生关系并不密切；6.可以采用磁珠分选的方法分选CD4+CD25+细胞亚群,分选成功率在90%左右,+14d CD4+CD25+嵌合率高于CD4+T细胞,则不易发生GVHD,反之则GVHD发生明显升高,可以作为+14d达到高比例嵌合患者的补充预警标志；7.本组移植患者24个月OS为56%,+7d嵌合率在65-85%的这组患者OS明显高于<65%及>85%组,定义为+7d的“最佳生存区间”,我们认为+7d嵌合率在65-85%之间是指导长期生存的又一重要指标。