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背景与目的:上皮细胞作为固有免疫防御机制的首道防线,在其遭受病原体及炎性因素等刺激后,可分泌趋化因子和炎症因子招募激活免疫细胞,并发挥非专职抗原提呈细胞功能,启动固有免疫应答。近年来发现上皮细胞亦可通过转分化形式发挥专职抗原提呈细胞功能,调节适应性免疫反应。我们课题组前期研究首先发现,肾炎早期肾小管上皮细胞可通过转分化表达树突状细胞(DC)表型分子DC-SIGN,具有独立激发T细胞免疫应答的DC样细胞功能,参与肾小管间质免疫损伤,与上述天然免疫分子DC-SIGN调节有关。鉴于DC-SIGN在肾小管上皮细胞表达的调控机制及其调节作用尚不甚清楚,故在课题组前期工作基础上,本研究拟探讨:(1)NF-κB-mTOR-RUNX1通路对肾小管上皮细胞DC-SIGN表达调控的影响;(2)DC-SIGN对肾小管上皮细胞炎症因子表达及其诱导T细胞激活及分化的影响。以期进一步阐释DC-SIGN对肾小管上皮细胞及其肾小管间质损伤的免疫调节作用,并为肾脏疾病防治提供新的干预策略和靶点。方法:(1)利用肾小管上皮细胞HK-2,给予TNF-α(20ng/ml)刺激,采用Western blot检测DC-SIGN及RUNX1蛋白表达水平;继而利用NF-κB抑制剂(Bay11-7082)、mTOR抑制剂(Rapamycin)以及mTOR siRNA,分别处理HK-2细胞并经TNF-α刺激,采用Western blot检测DC-SIGN及RUNX1蛋白表达变化。(2)利用RUNX1抑制剂(Ro5-3335)以及RUNX1 siRNA,分别处理HK-2细胞并经TNF-α刺激,采用Western blot检测DC-SIGN蛋白表达变化;继而利用HK-2细胞,构建过表达RUNX1稳转株并经TNF-α刺激,采用RT-qPCR及Western blot检测DC-SIGN mRNA及蛋白表达变化。(3)利用人胚肾上皮细胞系293T细胞,构建并转染含DC-SIGN启动子报告基因质粒,采用双荧光素酶基因报告系统,检测NF-κB抑制剂、mTOR抑制剂以及RUNX1抑制剂对TNF-α诱导DC-SIGN启动子活性的影响。(4)利用经DC-SIGN siRNA处理的HK-2细胞并经TNF-α刺激,采用RT-qPCR检测炎症因子TNF-α、IL-6、IL-8 mRNA表达变化。(5)利用上述经DC-SIGN siRNA处理以及TNF-α刺激的HK-2细胞,与人T细胞系Jurkat细胞进行共培养,采用RT-qPCR检测IL-2 mRNA表达变化;此外利用上述HK-2细胞与人初始CD4~+T细胞进行混合淋巴细胞反应,采用流式细胞术检测IFN-γ、IL-4表达变化。结果:(1)研究发现,TNF-α可呈时间依赖性上调HK-2细胞DC-SIGN及RUNX1表达;且可剂量依赖性上调293T细胞DC-SIGN启动子活性。(2)利用NF-κB抑制剂、mTOR抑制剂及mTOR siRNA干预,均可抑制TNF-α诱导的RUNX1及DC-SIGN上调表达;且NF-κB抑制剂、mTOR抑制剂以及RUNX1抑制剂亦均可抑制TNF-α诱发上调的DC-SIGN启动子活性。(3)继而发现,RUNX1抑制剂以及RUNX1 siRNA亦对上述TNF-α诱导的HK-2细胞DC-SIGN表达产生抑制效应。而利用过表达RUNX1的HK-2细胞稳转株,经TNF-α刺激后则可进一步上调DC-SIGN表达。(4)此外发现,经DC-SIGN siRNA干预,可下调TNF-α诱发HK-2细胞炎症因子TNF-α、IL-6、IL-8 mRNA的表达。(5)进一步发现,经上述DC-SIGN siRNA干预,可抑制HK-2细胞与Jurkat细胞共培养后的后者IL-2表达;亦可抑制或下调其与初始CD4~+T细胞共培养后的IFN-γ表达以及IFN-γ/IL-4比值。结论:本研究结果表明,NF-κB-mTOR-RUNX1通路参与调控TNF-α诱导的肾小管上皮细胞DC-SIGN表达,且提示RUNX1可能是启动肾小管上皮细胞DC-SIGN表达的关键转录因子。此外表明,DC-SIGN可调节TNF-α刺激肾小管上皮细胞炎症因子表达,并参与调控肾小管上皮细胞诱导T细胞激活及其Th1促炎应答,从而提示靶向DC-SIGN可为临床肾脏疾病防治提供新的干预靶点,有待进一步深入研究。