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目的:1.研究碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌(carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae,CRKP)的流行病学特征,为进一步预防及控制医院CRKP感染提供依据。2.明确临床分离耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌整合子分布及整合子与细菌耐药性的关系。3.研究本院流行碳青霉烯酶基因blaKPC-2周围基因环境,并探讨其传播的分子机制。方法:1.收集安徽理工大学附属奉贤医院2016年1月至2017年12月各种临床标本中非重复分离的84株CRKP菌,利用特异性聚合酶链反应(PCR)筛查常见碳青霉烯酶基因、毒力基因;使用PCR及测序技术确定菌株血清荚膜分型;采用多位点序列分型(MLST)方法分析菌株同源性。不同ST型别菌株根据情况选择相应株数通过接合试验确定碳青霉烯耐药基因是否位于可接合性质粒上。2.PCR筛查84株CRKP菌株的第1、2类整合酶基因,长片段PCR扩增整合酶基因阳性菌株的可变区,测序技术确定可变区启动子类型及基因盒组合,统计学分析整合子与细菌耐药性的关系。3.收集安徽理工大学附属奉贤医院2016年1月至2017年12月各种临床标本中非重复分离的携带blaKPC-2基因的79株CRKP菌,采用Junction PCR、Mapping PCR、测序拼接、反向PCR明确blaKPc-2的基因环境,分析blaKPC-2遗传环境的多样性。结果:1.由BD Phoenix 100全自动微生物分析仪进行菌种鉴定及体外药物敏感性试验后共筛选出84株CRKP菌株,其中79株(94.05%)检出blaKPC基因,经测序验证为WlαKPC-2基因;11株检出blfNDM,经测序验证为blaNDM-5,其中6株同时检出blaKPC-2 和blaDM-5;84 株 CRKP 菌株中未检出blαVIM、WaIMP、blaGES、blaOXA-23、WaVEB基因及高毒力荚膜血清型;84株CRKP菌株共检出8种克隆型别,呈现出多克隆传播的现象,其中ST290型为优势克隆型别;79株携带blaKPC-2基因CRKP菌株的主要克隆型别为ST290型(40株)和ST11型(29株),主要荚膜血清型是wzi21-K21型,占55.7%(44/79);11株携带blaNDM-5基因的分离菌中有7株是ST340型。ST290型、ST15型、ST1066型菌株可通过质粒接合实验而传递blaKPC-2 基因。2.76株CRKP菌株第1类整合酶基因intI1阳性,阳性率为90.4%(76/84),未检出第2类整合酶基因intI2。75株第1类整合酶阳性菌株成功扩增出两种不同长度的可变区,分别为1000 bp和1900 bp的片段。其中26株CRKP耐药基因盒为aadA2,其启动子为PcH1,49株CRKP耐药基因盒为dfrA12-orfF-addA2,其启动子为PcWTGN-10。3.blaKPC-2基因的周围环境存在多样性,除Tn1721-blaKPc-2-Tn3-IS26样结构占优势外,还发现另外5种序列模式,显示出blaKPC-2周围遗传环境的多态性,这表明blaKPC-2耐药基因的水平传播可能存在不同的机制。79株携带blaKPC-2基因CRKP菌株中共检测到五种质粒复制子类型(IncFIA,IncFIIS,IncFrepB,IncN,IncT),其中65株携带两个或多个质粒复制子。40株携带blaKPC-2基因ST290型分离菌中有35株的质粒复制子类型组合为IncFIA+IncFIIS,表明它们具有很强的质粒相容性,并易于通过质粒传播获得耐药基因。结论:CRKP菌株耐药情况较严峻,与携带耐药基因blaKPC-2和blaNDM-5有关;CRKP菌株共有8种克隆型别,呈现出多克隆传播;首次报道携带blaNDM-5基因的ST340型肺炎克雷伯菌,也是首次报道同时携带blaKPC-2和blaNDM-5基因ST340型肺炎克雷伯氏菌;CRKP菌株中第1类整合子检出率较高,广泛分布的第1类整合子与CRKP高耐药率有一定的联系;blaKPC-2基因的周围环境存在多样性,可能存在新的传播方式。图[4]表[11]参[40]