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醋酸菌在食醋工业化生产过程中的广泛应用得益于其突出的高产酸、耐酸性能,而以吡咯喹啉醌(PQQ)为辅酶的乙醇脱氢酶(PQQ-ADH)在此过程中扮演着重要角色,因其能将乙醇氧化生成乙醛,进而在乙醛脱氢酶的作用下转化成乙酸。本文以从浙江传统玫瑰醋中分离得到的巴氏醋杆菌Ab3为出发菌株,借助Tat表达体系并融合抗性基因对其乙醇脱氢酶大亚基(AdhA)进行可溶性表达的探索和定向进化筛选,为周质蛋白基因的可溶性表达及功能筛选提供了方法论。基于生物信息学分分析方法,本文首先对不同醋酸菌中的AdhA进行比对分析,包括信号肽预测,二级结构、三级结构的预测与分析等,阐述了不同醋酸菌中AdhA在序列上以及结构上的区别,同时指出可能且容易发生突变的影响AdhA活性的位点。在此基础上构建AdhA的Tat-bla表达体系,结合易错PCR的方法对巴氏醋杆菌AdhA进行了定向进化。生物信息学结果表明,不同醋酸菌的AdhA上均存在一段含有双精氨酸基序S-R-R-x-F-L-K的独特信号肽,能够被细菌Tat表达系统识别,从而实现跨膜转运。通过AdhA的氨基酸序列的比对及每个氨基酸位点的剖析可知,在巴氏醋杆菌Ab3的AdhA的氨基酸序列中,与高产酸、耐酸的Komagataeibacter相比较,Ala30Thr、Val31Met、Pro32Ala、Ala33Ser、Asp36Asp、Glu43Glu、Glu53Gly、Lys262Gln、Pro266Pro、Lys267Thr、Ser289Ala、Ile311Lys、Gln393Val、Leu402Lys、Lys457Thr、Glu508Ala、Thr509Glu、Va1510Ala、Trp511Trp、Gly559Gly、Asp639Asp、Met662Val、Thr697Gly、Asn731Gly 这些位点的改变可能会引起其二级结构的改变,预示着ADH的活性与这些位点有关,并进而影响醋酸菌的耐酸性。在生物信息学分析的基础上,成功克隆了adh 基因及氨苄抗性基因,构建了重组质粒pADH-Bla,实现了adh 基因在大肠杆菌周质空间的可溶性表达和定向进化。利用大肠杆菌Tat表达系统的独特优势,选用易错PCR的方法对adhA基因定向进化,抗性平板筛选出氨苄抗性能力提高的突变菌株M14,M21,M28,M44,M59和M60。M14与M21的adhA基因有3个突变位点A158G,C290G,A784C,对应的氨基酸突变为 Glu53Gly,Ala97Gly,Lys262Gln。M28 与 M60的adhA基因的突变位点为A158G,C1204G,对应的氨基酸突变为Glu53Gly,Leu402Lys。其中M14和M28有共同的突变位点A158G。M44的adhA基因共有5个突变位点,分别为A129G,G643T,A1523C,C1677A 和 A1984G,对应的氨基酸突变为 Glu43Glu,Ala215Ser,Glu508Ala,Gly559Gly 和 Met662Val。M59的a h 基因的突变位点为 T473A,T1529C,对应的氨基酸突变为 Phe158Tyr,Val510Ala。本课题的开展揭示了部分对乙醇脱氢酶活性影响的位点,这为进一步定向改造ADH,提高ADH的活性提供了理论依据。同时Tat体系的成功开发也为研究醋酸菌中其它关键酶提供了基础。