鹅圆环病毒遗传进化分析及与鹅星状病毒双重荧光定量PCR检测方法建立

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鹅圆环病是由鹅圆环病毒(Goose circovirus,GoCV)引起的以腹泻,生长缓慢和羽毛凌乱等临床症状的一种传染病。GoCV感染鹅后主要侵害淋巴组织器官,从而导致免疫力下降,继而增加继发感染。该病是目前危害养鹅业的病原之一。截止目前,我国的浙江、山东、台湾、广西、广东等多个省份均有该病的报道。安徽省尚没有对该病的报道,因此本研究从临床上对来自安徽省部分地区的病料进行GoCV的检测,同时对其开展了遗传进化分析。首先,本研究从安徽不同地区采集了25份病鹅的肝、法氏囊、脾脏、小肠和肾脏临床样本,这些病鹅具有发育不良、消瘦、内脏器官有尿酸盐沉积等症状。利用Primer Premier5.0软件,设计1对针对Rep基因的特异性检测引物,利用PCR技术进行GoCV检测。结果表明,共检测出6份GoCV阳性样本。随后,利用软件设计了3对引物,对其中2株GoCV进行全基因组序列的扩增。结果表明,成功扩增出全基因组序列。并将其提交至Gen Bank,命名为AAU109(Gen Bank登录号MW560282)和AAU111(Gen Bank登录号:MW879363)。接着利用在线网站NCBI-Open Reading Frame Finder,对GoCV的开放阅读框(Open Reading Frame Finder,ORF)进行了全基因组结构分析。结果表明,2株GoCV编码4个阅读框,分别是V1、C1、V2和C2。V1阅读框编码复制相关Rep蛋白,由293个氨基酸组成;C1阅读框编码衣壳Cap蛋白,由250个氨基酸组成。最后,利用Meg Align和MEGA6.0软件基于全基因组、Rep和Cap基因进行了核苷酸、氨基酸相似性分析和遗传进化分析。结果表明,基于全基因组序列分析,2株GoCV全基因组核苷酸相似性为91%,氨基酸相似性为92%。基于Rep基因序列分析,2株GoCV核苷酸相似性为92.4%,氨基酸相似性为94.9%。基于Cap基因序列分析,2株分离株Cap基因之间的核苷酸相似性为97.3%,氨基酸相似性为96.3%。全基因组遗传进化分析结果显示AAU109株与山东的参考株(Gen Bank登录号:KT387277.1)形成了一个小的分支,AAU111与台湾参考株(Gen Bank登录号:AF536941.1)形成一个小的分支。Rep基因遗传进化结果与全基因组相似。Cap基因的遗传进化结果表明,2株GoCV与北爱尔兰的GoCV(Gen Bank登录号:AJ304456.1)形成了一个单独聚类。此外安徽株AAU111在Cap区域上存在重组现象的发生。本研究为进一步了解安徽省GoCV的遗传进化情况提供了数据支持。由于在临床检测中存在GoCV和GAstV的双重感染情况,因此本研究首次建立了能同时且快速检测GoCV和GAst V的双重SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法,为两种病毒提供早期诊断的技术支持。首先,利用软件,针对GoCV的Rep基因和GAst V的ORF2基因设计了2对特异性引物,建立一种简便、灵敏、特异性高的双重SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法。该方法可以通过熔解曲线的熔点来区分GoCV(84.5℃)和GAst V(81.0℃)。实验结果显示,该方法能够不受4型禽腺病毒(Fowl adenovirus serotype 4,FAd V-4)、鹅细小病毒(Goose parvovirus,GPV)和禽白血病毒(Avian leukosis virus,ALV)等病毒的影响,具有良好的特异性。GoCV和GAst V的检出最低值分别为51.6拷贝/μL和37.5拷贝/μL。组内组间变异系数均小于1%,表明该方法具有良好的重复性。临床样本检测结果表明,建立的方法的阳性检出率为12%(3/25),高于传统PCR的检测结果(4%,1/25)。综上所述,本研究对安徽部分地区GoCV进行了遗传进化分析,同时建立了能够同时检测GoCV和GAst V双重SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法。研究结果将有助于我们更好的了解安徽地区GoCV的遗传进化情况,也为GoCV和GAst V的快速诊断奠定了一定基础。
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