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鸡肺表面活性蛋白A（chicken Surfactant Protein A,cSP-A）是鸡肺上皮细胞分泌的一种亲水性糖蛋白,具有非特异性的抗病原微生物功能。天然cSP-A蛋白对多种革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均具有良好的抑菌作用,但从鸡肺灌洗液中提取制备cSP-A蛋白的过程繁琐,不仅产量低而且成本昂贵。一般的原核表达和真核表达cSP-A很难获得理想的效果。本文通过连接异亮氨酸拉链结构在大肠杆菌,利用白介素2启动子在293T细胞以及利用慢病毒系统建立稳定表达cSP-A的细胞系,并对获得的重组cSP-A蛋白进行了致病菌抑菌效果评价,为后续研究cSP-A抑菌机制以及临床应用奠定基础。1连接异亮氨酸拉链结构在大肠杆菌表达cSP-A通过两个亮氨酸短肽将cSP-A的N端与一段人工合成的异亮氨酸拉链结构相连接,构建重组IZ-Leu2-cSP-A,再插入到p ET-32a载体上,构建重组载体p ET-32a-IZ-Leu2-cSP-A,转化到BL21（DE3）感受态细胞中,加入不同浓度异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）于16°C、30°C、37°C中分别诱导表达24 h、12 h、6 h,超声波破碎裂解,经变性复性纯化后,分别进行SDS-PAGE和Western Blot检测。结果显示:cSP-A蛋白最优条件是诱导温度为30°C、IPTG浓度为0.5 mmol/L,cSP-A融合蛋白大小为44 k Da。Western Blot结果显示,该蛋白可被cSP-A单抗识别。抑菌试验显示,与卡那霉素阳性对照相比,大肠杆菌表达的重组cSP-A无抑菌活性。2利用白介素2启动子在293T细胞瞬时表达cSP-A将cSP-A全基因插入含有白介素2启动子的表达质粒p KMD-IL中,构建p KMD-IL-cSP-A重组载体,转化DH5α感受态细胞,无内毒素抽提质粒,转染293T细胞进行瞬时表达与鉴定,然后进行200 m L培养体系放大表达,利用镍柱亲和层析法进行纯化。SDS-PAGE检测结果,cSP-A蛋白大小为24 k Da,与预期相符。Western Blot结果显示,该蛋白可被cSP-A单抗识别。BCA法测定蛋白浓度,计算出样品值的蛋白浓度分别为0.4 mg/m L、0.35 mg/m L、2 mg/m L。抑菌试验结果显示,与卡那霉素阳性对照相比,cSP-A蛋白在Ca2+作用下对肠炎沙门氏菌ATCC13076有一定的抑菌作用,对其他指示菌均无明显的抑菌作用。微量抑菌试验结果显示,cSP-A蛋白在Ca2+作用下对肠炎沙门氏菌ATCC13076最小抑菌浓度为100μg/m L。3稳定表达cSP-A细胞株的建立及对致病菌初步评价将cSP-A片段插入携带绿色荧光基因（green fluorescent protein,GFP）的慢病毒载体p CDH-S-His中,构建p CDH-S-GFP-His-cSP-A转移载体。将p CDH-S-GFP-His-cSP-A质粒和辅助质粒p MD2.G、p SPX2.G按照一定比例共转染于293T细胞,命名为p CDH-GFP-cSP-A;设空载体对照组,命名为p CDH-GFP。将包装好的慢病毒颗粒感染293T细胞48 h,观察细胞GFP的表达情况,使用2.5μg/m L的嘌呤霉素对阳性细胞加压筛选,筛出293T-GFP-cSP-A细胞系和293T-GFP细胞系,结果显示,在转染48 h后两组荧光数量均可达到80%左右。p CDH-GFP-cSP-A组和p CDH-GFP组滴度分别为1.43×10~6 TU/m L和2.58×10~7TU/m L。RT-PCR检测结果表明,在293T-GFP-cSP-A细胞系有cSP-A m RNA表达,而293T-GFP细胞系中无cSP-A m RNA表达。Western blot检测结果表明,293T-GFP-cSP-A细胞系有cSP-A蛋白表达,而293T-GFP细胞系中无cSP-A蛋白表达。抑菌试验结果显示,与卡那霉素阳性对照相比,cSP-A蛋白在Ca2+（终浓度为2.5mmol/L）作用下对大肠埃希氏菌CMCC44102、甲型副伤寒沙门氏菌ATCC9150、肠炎沙门氏菌ATCC13076均有一定的抑菌作用。本试验在大肠杆菌、293T细胞和慢病毒系统3种方法中表达了重组cSP-A蛋白,大肠杆菌表达的重组cSP-A无抑菌活性;293T细胞瞬时表达的cSP-A仅对肠炎沙门氏菌ATCC13076有一定的抑菌作用;在慢病毒表达系统中表达的重组cSP-A蛋白对大肠埃希氏菌CMCC44102、甲型副伤寒沙门氏菌ATCC9150、肠炎沙门氏菌ATCC13076有一定的抑菌作用。本试验旨在探索通过不同表达系统表达蛋白,选择对多种致病性菌具有抑制作用的重组cSP-A蛋白。利用PCR技术,克隆重组cSP-A基因,并构建其原核、293T细胞和慢病毒表达系统3种表达质粒,在这三种表达系统中诱导表达出重组cSP-A。通过一系列抑菌试验评价cSP-A蛋白对致病菌的抑菌效果,以便于进一步探索通过基因工程技术对大规模生产禽源cSP-A蛋白提供支撑,同时为禽源肺表面活性物质制剂研发奠定基础。