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柑橘是世界第一大果树,柑橘珠心胚特性是独特的无融合生殖现象。这一现象一方面导致柑橘常规育种难以产生真正杂种,因此育种进展缓慢。另一方面由于珠心苗的遗传组成与母本一致,可以在柑橘生产砧木育种中广泛利用,产生性状整齐一致的后代。柑橘珠心胚形成的机理研究一直受到广泛关注,前人对柑橘属和枳属的不同遗传群体进行了遗传定位,但尚未鉴定到控制珠心胚性状的候选基因。本研究利用特有的短童期材料山金柑(Fortunella hindsii),通过构建杂交分离群体,并结合柑橘属、枳属杂交群体分析,定位控制珠心胚性状的关键基因。利用特有的山金柑单胚和多胚材料,用转录组测序的方法对两者胚珠进行了差异基因挖掘,首次挖掘到柑橘珠心胚候选基因CitRWP,并对该基因进行初步分析验证,同时开发了有效的分子标记可以在柑橘属中区分单胚和多胚品种。主要研究结果如下:1、多个遗传群体锁定控制柑橘珠心胚性状的候选区域本研究利用短童期的山金柑种质资源,以来源于广东和福建的5个单胚山金柑为母本,以来源于江西的1个多胚山金柑为父本,创建了F1代分离群体,通过分子标记检测得到杂种共1321株,杂种率为95.24%。2015至2016年连续两年对5个山金柑杂交群体的胚性进行了分析,发现单胚和多胚的分离比均为1:1。将30个单胚和30个多胚的子代DNA分别进行混池,利用BSA-seq法对混池进行测序,将金柑属珠心胚性状锁定到甜橙参考基因组4号染色体上特定位置。在山金柑分离群体中筛选到重组单株36个,利用重组单株将金柑属珠心胚性状进一步缩小到3.51MB-3.75MB区域内,该区域内共35个基因,其中17个基因与共分离标记连锁。连续5年对HB柚(Citrus grandis)×Fairchild橘(C.reticulata×Citrus grandis)的杂交F1分离群体已结果的后代进行表型分析,5年结果总计单胚后代66株,多胚后代58株,单胚和多胚的分离比例近似1:1。利用BSA-seq法对20个单胚子代和20个多胚子代分别进行DNA混池分析,将控制珠心胚性状的基因定位于4号染色体2.5Mb至3.9Mb区间。利用分子标记对该位点在此群体中进行了验证,并将候选定位区域缩短到480Kb内,该区域内77个基因,同时也确认控制金柑属和柑橘属多胚性状基因处于同一个位点,并与前人报道的区域相符。连续3年对两个多胚材料红橘(C.reticulata)×枳壳(Poncirus trifoliata)杂交F1群体进行表型鉴定,共检测到39株为多胚,28株为单胚,分离比例趋近2:1或1:1。将前面柑橘属和金柑属群体定位到的候选位点在该杂交群体中做了遗传连锁验证,发现有子代中有59株的表现型与该位点的基因型连锁,但有8个多胚植株与该区段不连锁,并发现该区段内与性状连锁的标记均来源于红橘亲本,而枳壳亲本中杂合标记在该区域并没有连锁现象,推测枳壳中可能存在其他控制位点。2、RNA高通量测序挖掘山金柑珠心胚起始发育相关基因山金柑有无融合生殖和有性生殖两种类型,通过对无融合生殖起始发育时期进行细胞学观察,确定花前胚囊单核时期和花后双核胚囊时期为无融合生殖起始关键时期,对这两个时期的胚珠进行RNA高通量测序。通过denovo转录组分析,共获得66,699个unigenes和156040个转录本,其平均长度分别为1647bp和900bp。利用Nr,Nt和Swiss-Prot三个数据库对unigene进行同源序列比对,分别注释3,665(35.48%),15,959(23.92%),18,267(27.39%)个unigene。基因差异表达分析发现,珠心胚起始细胞开始出现的阶段中,与单胚胚珠相比多胚胚珠有316个基因上调表达,557个下调表达;珠心胚起始细胞大量出现的阶段中,多胚胚珠有532个基因上调表达,541个下调表达。通过分析候选区域内基因的表达差异发现CitRWP基因(comp57556_c0,Cs4g05960)可能为珠心胚发育的关键基因。此外,KEGG相关途径分析显示激素信号路径有差异,差异基因中共检测到25个差异表达基因与生长素和细胞分裂素转导途径相关。从差异基因中随机挑选20个基因进行q PCR验证,结果表明RNA-seq数据可靠。3、柑橘无融合生殖候选基因CitRWP的功能分析和相关分子标记的开发应用克隆了HB柚、Fairchild橘、克里曼丁橘、山金柑等品种的CitRWP基因,发现品种间仅有极少SNP差异。实时定量PCR分析表明,CitRWP在晚白柚(C.grandis cv.Wanbai)、枸橼(C.medica)、克里曼丁橘(C.clementina)等单胚品种的胚珠中低表达,但在Flame葡萄柚(C.paradisi cv.Flame)、柠檬(C.limon)、椪柑(C.reticulata cv.Ponkan)、伏令夏橙(C.sinensis cv.Valencia)等多胚品种中则高表达;选取5个胚珠发育时期分析CitRWP表达水平,结果表明CitRWP随着胚珠发育表达水平逐渐降低,在多胚山金柑中的表达水平显著高于单胚。在HB×FC分离群体中,多胚胚珠中该基因的表达量是单胚中上百倍,并且多个时期结果一致。亚细胞定位表明该基因主要定位于在细胞核中,同时在细胞质中也有少量分布。进化分析表明CitRWP不属于拟南芥已报道的RKD家族,而与小立碗藓Pp RWP3和Pp RWP4以及地钱Mp RWP1更为相近。多胚品种中CitRWP启动子区域存在一个特异插入的MITE转座子。利用该转座子开发出候选基因相关联的分子标记mite_p1,并在786份柑橘属种质资源中进行验证,证明该标记与多胚性状完全连锁。此外,构建了该基因超表达载体,在拟南芥中进行遗传转化验证。