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基因组 DNA甲基化能够响应外界环境的变化,通过影响基因表达的模式,引发表型的可塑性,是物种适应性进化的重要因素。昆虫被认为是研究DNA甲基化的良好材料,其众多的生理生化过程均由DNA甲基化参与调控。小菜蛾长期与十字花科寄主植物相互作用和协同进化,能够快速适应各种十字花科植物的防御物质和不同类型的农药,严重影响全球十字花科蔬菜的生产。DNA甲基化是否与其强大的环境适应能力有关,值得探究。本研究基于实验室成功破译全基因组信息的福州敏感品系,探究了小菜蛾DNA甲基化的基本特性,并利用萝卜-拟南芥转寄主体系,追踪了寄主环境的改变对小菜蛾基因组DNA甲基化含量和分布模式的影响,并测定了相关基因的甲基化和表达水平,为“环境-DNA甲基化-基因表达”三者的联系提供更多丰富的证据。主要结果如下: 1.小菜蛾基因组DNA甲基化特性 利用酶切实验,证实小菜蛾存在低水平的基因组DNA甲基化,与生物信息学预测的结果一致,且不同发育阶段在CCGG位点甲基化无可见差异;而5mC试剂盒的检测结果表明DNA甲基化的含量随生长发育动态变化,具有卵期和雌虫期相对高含量的模式。 2.小菜蛾DNA甲基化转移酶 小菜蛾全基因组中仅发现单拷贝的DNMT1和DNMT2。分段扩增克隆得到DNMT1全长序列,其中PxDNMT1含有4422 bp的开放阅读框(ORF),其表达模式呈现卵期、雌虫期高表达,幼虫低表达的特性。氨基酸序列分析表明小菜蛾DNMT1与家蚕的序列最为接近,大多数昆虫DNMT1都丢失了N-端重要调控序列,暗示昆虫DNMT1与哺乳动物DNMT1在作用机制上可能存在不同。 3.寄主转移前后DNA甲基化含量和DNMT1表达模式 5-mC含量检测和 F-MSAP的方法皆证实,萝卜苗世代(Gck)与拟南芥第一代(G1)的甲基化模式相近,而拟南芥第二代(G2)和拟南芥第三代(G3)各自具有新的模式。同时,转寄主前后以及世代之间,DNMT1表达模式相符,但将小菜蛾从萝卜苗转移到拟南芥后其不同发育阶段的DNMT1表达量显著降低,并随着代数的增加而进一步下降。这些数据说明外界环境的改变会影响小菜蛾固有的甲基化模式,且新的模式在短期内很难建立。 4.转寄主前后差异甲基化基因的分析 回收转寄主前后幼虫阶段MSAP方法中显示的差异条带,明确了18条甲基化差异序列,其中8条属于外显子区域,7条属于内含子区域,3条属于启动子区域,且甲基化偏好发生在神经和信号转导相关基因中。进一步挑选9个基因探究其 DNA甲基化与基因表达的关系,发现基因的甲基化模式和表达模式皆在Gck和G1之间聚类,说明亲本的经历在基因水平上能够对子代DNA甲基化的含量和基因表达产生影响;基因之间,启动子区低甲基化对应基因低表达,而基因区高甲基化与基因表达量之间并无对应关系。 本研究从DNA甲基化层面研究了昆虫如何适应新的环境,从中鉴定了可能参与该过程的差异甲基化基因,为利用不同类型十字花科作物的间作套种防控小菜蛾的可行性提供理论依据。