水稻锯齿叶矮缩病毒(Rice ragged stunt virus, RRSV)是呼肠孤病毒科(Reoviridae)水稻病毒属(Oryzavirus)的重要成员。RRSV侵染水稻引发水稻锯齿叶矮缩病曾广泛流行于印度尼西亚、菲律宾、越南及中国福建、广东、台湾、江西、湖南、浙江等东南亚国家和地区的水稻种植区，给水稻生产和粮食安全构成重大威胁。RRSV自发现以来，国内外研究学者在病原性质、介体昆虫传毒特性及RRSV基因组分子生物学等方面作了系统的研究，2010年至今也对RRSV基因组编码的三个非结构蛋白Pns6、Pns7和Pns10的生物学功能做了一些研究。例如，Pns6同时具有病毒运动蛋白和病毒沉默抑制子的功能；Pns7可能参与了RRSV在介体昆虫或寄主植物中的扩散过程；Pns10则是形成病毒原质和病毒在介体昆虫褐飞虱体内的复制所必须的。然而，关于 RRSV的致病机制尚不清楚，也无法提出行之有效的防控水稻锯齿叶矮缩病的方法。RRSV侵染水稻后诱导水稻产生植株矮小、分蘖增多、叶尖卷曲及叶缘缺刻呈锯齿状等病害症状，结合small RNA在调控植物生长发育和叶片形态建成以及生物胁迫中的关键作用，本研究试图从small RNA的角度深入解析RRSV致病或寄主抗病过程的分子机制。　　基于上述研究目的，我们首先通过small RNA深度测序，分析了RRSV侵染水稻前后内源small RNA尤其是microRNA(miRNA)的表达变化。结果显示：RRSV侵染影响了水稻内源 small RNA的表达，其中，RRSV侵染显著诱导了与叶片发育密切相关的miR319、miR164和 miR156的高表达。Northern blot也证实了miR319、miR164和 miR156在RRSV侵染后均被显著诱导表达的结果。然而，相比于miR164和 miR156，miR319受到RRSV侵染的诱导最为明显。因此，为了深入揭示miR319是否参与RRSV侵染水稻的致病或抗病过程，我们利用水稻遗传转化体系获得了miR319a和miR319b转基因过表达水稻株系。结果显示，miR319转基因过表达的水稻株系呈现出植株矮小、分蘖增多、叶片浓绿变宽且叶面皱缩等类似于RRSV侵染水稻后诱导产生的病害症状的异常表型。为了揭示miR319过表达是否影响RRSV的侵染，我们将对照组水稻样品和miR319a和miR319b转基因过表达水稻株系分别接种RRSV，结果显示miR319转基因过表达水稻对RRSV侵染更加敏感，表现为症状加重，发病率更高。以上结果表明病毒诱导miR319的高表达参与了RRSV致病过程，并有利于病毒致病。　　鉴于miR319在RRSV致病过程中的作用，我们想知道miR319是调控哪个靶基因参与致病过程?基于此，我们深入分析了miR319的靶基因对水稻生长发育和在病毒致病过程中的作用，我们利用水稻遗传转化体系获得了miR319靶基因TCP21、PCF5、PCF6和PCF8的RNAi转基因水稻，结果发现TCP21RNAi转基因水稻表型模拟了RRSV侵染水稻诱导的症状及miR319a和miR319b转基因过表达水稻的表型，而PCF5、PCF6和PCF8的RNAi转基因水稻与野生型水稻在水稻营养生长阶段表型无明显差异。为了全面揭示miR319调控TCP21在 RRSV致病过程中的作用，我们获得了 TCP21转基因过表达(TCP21 OE)和miR319-TCP21 Resistance(TCP21 Res)转基因过表达水稻，这些过表达水稻在其营养生长阶段并没有呈现出发育上的异常表型。随后，我们将TCP21 RNAi、TCP21 OE和TCP21 Res和对照组水稻分别接种RRSV，观察在病害症状严重程度上的差异并统计发病率。结果显示，相比于对照组水稻，TCP21RNAi转基因水稻对RRSV侵染更加敏感，而TCP21OE转基因水稻特别是TCP21 Res转基因水稻对RRSV侵染则不敏感。上述研究结果进一步证实，病毒通过诱导miR319的高表达调控TCP21参与了病毒致病过程。　　那么，miR319及其调控的靶基因TCP21是如何影响水稻对RRSV侵染的敏感性呢？基于 miR319调控的TCP蛋白可作用于植物茉莉酸生物合成及水稻茉莉酸在抵抗病原物侵染过程具有重要作用等研究背景，我们推测miR319转基因过表达水稻和TCP21RNAi转基因水稻对RRSV侵染的敏感性增强可能是由于miR319/TCP21对水稻茉莉酸生物合成和信号转导过程的操纵所引起。首先，RRSV侵染水稻后的基因芯片结果及Realtime-PCR的验证结果表明，与茉莉酸生物合成和信号转导相关基因的表达受到RRSV侵染的影响。LC-MS也进一步测定了同时期RRSV侵染水稻样品和健康水稻样品中茉莉酸的含量发现RRSV侵染水稻后显著降低了水稻茉莉酸的含量。为明确miR319和TCP21是否参与调控茉莉酸生物合成和信号转导过程，我们检测了 miR319a转基因过表达水稻、TCP21RNAi、TCP21 OE以及TCP21 Res转基因水稻中PLDα1、LOX5、LOX11、COI1b、COI2和JAZ8等茉莉酸生物合成和信号转导过程相关基因的相对表达量差异，结果显示，miR319和TCP21的确调控了水稻茉莉酸的生物合成及信号转导相关基因的表达；LC-MS也进一步测定了样品间茉莉酸含量的差异，结果显示茉莉酸在miR319a转基因过表达和TCP21RNAi转基因水稻中的含量明显低于对照组水稻样品中茉莉酸的含量，而TCP21Res转基因过表达中茉莉酸的含量则高于对照组水稻样品中茉莉酸的含量。另外，通过野生型水稻外施茉莉酸甲酯及茉莉酸生物合成抑制剂 DIECA并接种 RRSV实验发现外施茉莉酸甲酯诱导了病程相关基因（Pathogenesis-related genes, PRs）的表达而抑制了RRSV在水稻体内的积累，而外施DIECA则抑制了PR基因的表达而促进RRSV在水稻体内的积累。以上结果表明miR319调控TCP21可能是通过影响水稻内源激素茉莉酸的含量改变了水稻对RRSV的敏感性。　　本研究解析了miR319及其靶基因TCP21参与了RRSV致病过程。本文研究结果为植物病毒特异诱导一个miRNA的表达一方面利于病毒侵染，一方面诱导病害症状产生提供了一个具体例子。另外，在小麦-水稻黑条矮缩病毒系统中我们也初步发现 miR319及其靶基因可能参与水稻黑条矮缩病毒致病或诱导小麦病害症状形成过程。因此，我们推测miR319及其靶基因通过调控茉莉酸的合成参与的病毒致病或病毒症状形成机制具有一定的普遍性。