背景支气管哮喘(简称哮喘)(bronchial asthma,asthma)是呼吸系统常见病、多发病之一,对人类健康构成了很大的威胁。世界卫生组织的统计结果显示,全球约有3亿哮喘患者,其中每年约有一千五百万人因为该病而丧失劳动能力。据不完全统计,我国至少也有1500万到2000万哮喘患者,世界各地支气管哮喘的发病率、死亡率都呈逐年增高趋势,每年造成了异常巨大的经济损失,哮喘已经成为严重的公共卫生问题。哮喘反复发作且病因复杂,在宿主易感因素与环境因素相互作用下,以慢性气道炎症和气道重塑为基本病理生理改变的综合征,是一种可以控制但很难治愈的疾病。研究哮喘的发病机理,预防和控制哮喘变态反应性炎症的发生和发展,受到越来越多研究者的关注。在哮喘气道炎症发展过程中,CD4+T细胞群中的初始T细胞经变应原诱导激活后成为Th0细胞,并继续朝Th2细胞方向分化,生成大量的Th2细胞,Th2细胞占据优势地位,可大规模诱发下游的IgE和／或非IgE介导的Th2炎症。哮喘发病过程中,炎性细胞在气道组织中的浸润、聚集、激活和释放是其主要特征,在此过程中细胞因子发挥了重要作用。慢性炎症反复刺激和上皮结构的破坏可以引起哮喘的气道重塑。目前,气道炎症与气道重塑作为哮喘的两个病理特征逐渐被人们所接受。引起气道重塑的各种细胞因子、炎症介质等在气道重塑中发挥作用的机制尚未完全明确。白细胞介素21(interleukin21,IL-21)是2000年发现的一种细胞因子,属于Ⅰ型细胞因子家族,主要是由CD4+Th2细胞合成和分泌,与IL-2、IL-4和IL-15具有同源性。自从发现了IL-21以后,关于它的生物学功能成为了研究的热点。IL-21的效应是多样的,主要是由于IL-21的受体分布广泛。IL-21开始时被认为是激活的外周血T细胞分泌的细胞因子,现在被认为可以由一系列分化型CD4+Th细胞合成,生物学功能主要是刺激T细胞增殖、NK细胞增殖和分化以及CD40特异性应答B细胞的增殖。IL-21受体(IL-21R)表达于淋巴造血细胞、成纤维细胞、角质细胞、肠上皮细胞。实验证明,IL-21在先天性免疫、适应性免疫及细胞内的免疫应答中发挥重要的作用,与多种自身免疫性疾病及炎性疾病有关,例如类风关、系统性红斑狼疮、系统性硬化病、炎症性肠病、过敏性疾病,对于这些疾病有重要的免疫调节作用。IL—21在Th细胞的分化方面起了关键作用,支气管哮喘是一种免疫异常导致的变态反应性疾病,免疫功能紊乱在哮喘发病中起十分重要的作用,T细胞的不同方向的分化决定哮喘疾病是否发生,Th1/Th2失衡及Th17/Treg失衡理论一直是研究的热点。Th1/Th2细胞之间处于相互抑制状态,正常情况下,Th1/Th2细胞处于恒定状态,哮喘患者Th1细胞功能下降,Th2细胞功能异常增高。Treg细胞数量减少、其抑制炎症反应的功能降低,而Th17细胞过度表达介导气道炎症。IL—21是CD4+Th2型细胞分泌的细胞因子,可以促进Th17细胞的分泌,有人认为Th17细胞又是IL—21生成的一个重要来源,由此推断IL—21可能参与哮喘疾病的发病。2009年,Rajshekhar Chatterjee第一次报道了IL-21基因多态性与哮喘显著相关。IL-21功能的发挥依靠其受体的共用γ链,主要通过JAK-STAT途径传递信号。IL-21R蛋白由538个氨基酸组成,与IL-2Rβ链、IL-4R α链和IL-9R有同源性,N端有4个高度保守的Cys残基,跨膜区有"WSXWS"序列,胞浆区存在经典的信号传递亚单位boxl和box2基序,表明该受体具有信号传导功能。IL-21与IL-21R结合时,主要通过与γ c的偶联,激活JAK1和JAK3(特别是JAK3),活化的JAK酪氨酸激酶使STAT1和STAT3发生磷酸化,磷酸化STAT移行到细胞核内,起到活化T细胞核因子(NFAT)的作用,诱导IL-21基因表达。JAK-STAT途径参与许多细胞因子信号转导而影响Th细胞分化和Th细胞免疫偏移,是哮喘发病重要的信号通路。哮喘小鼠肺组织IL-21及IL-21R表达未见报道。本研究建立慢性哮喘小鼠动物模型,用不同的实验方法观察IL-21、IL-21R、STAT3、P-STAT3在哮喘小鼠肺组织的表达,使用地塞米松及酪氨酸激酶(JAK,janus Kinnase)抑制剂AG490进行干预,观察IL-21对哮喘气道炎症及气道重塑的影响,探讨IL-21/STAT3信号通路在哮喘发病中所起的作用。研究目的1、用不同的实验方法观察IL-21、IL-21R在小鼠及哮喘小鼠肺组织中的表达,观察IL-21及其受体与气道炎症、气道重塑指标的关系。2、观察STAT3、活化后的STAT3(p-STAT3)在哮喘小鼠的表达及其与气道炎症、气道重塑的关系。3、使用JAK通路抑制剂AG490腹腔注射后观察哮喘小鼠气道炎症及气道重塑指标的变化,观察肺组织总STAT3、p-STAT3的表达变化,观察IL-21表达的变化。4、使用地塞米松干预哮喘小鼠后,观察对哮喘小鼠气道炎症的改变及对IL-21/STAT3信号通路的影响。研究方法1、动物模型的建立和分组SPF级BALB/C雌性小鼠,共44只,随机分为4组,分别为对照组、哮喘组、AG490组、地塞米松组,每组11只。哮喘组于第1天、第14天每只小鼠腹腔注射0.2mL致敏液,致敏液含卵蛋白(OVA, Grade V)10ug,氢氧化铝凝胶100ug,第21天开始,雾化吸入25g/L的OVA溶液30min,每周3次,共8周。对照组以生理盐水代替OVA。地塞米松组在每次雾化OVA溶液前0.5h腹腔注射10mg/kg地塞米松溶液。AG490组是于第21天开始腹腔注射AG490,按每只小鼠每次450ug,每周3次,连续8周,每5mgAG490用0.5mL二甲基亚砜(0.05%)、9.5mL双蒸水充分溶解。2、IL-21及IL-21R在慢性哮喘小鼠肺组织的表达在末次雾化吸入24h后,左肺行肺泡灌洗,收集灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid, BALF),离断颈椎处死小鼠。左肺组织放入液氮罐用于提取RNA及总蛋白。右肺组织石蜡包埋切片行HE染色,并用免疫组化染色观察IL-21、 IL-21R在小鼠肺组织中的表达,采用荧光定量PCR法检测肺组织IL-21mRNA、 IL-21R mRNA的表达,western blot法检测IL-21蛋白、IL-21R蛋白的表达。3、IL-21及IL-21R与气道炎症和气道重塑的关系肺泡灌洗液离心后,取沉渣用血细胞计数板进行细胞分类及计数,重点观察细胞总数及嗜酸性粒细胞数、中性粒细胞计数变化：肺组织行HE染色观察气道及肺组织病理学改变；肺组织石蜡切片HE染色后,用IPP6.0图像分析软件分析单位长度基底膜气道壁面积(气道壁厚度,total bronchial wall area/basement membrane perimeter, WAt/Pbm)、单位长度基底膜的气道平滑肌面积(平滑肌厚度,the area of the wall occupied by smooth muscle/basement membrane perimeter, WAm/Pbm);分析IL-21、IL-21R与WAt/Pbm、WAm/Pbm指标的相关性。4、STAT3、p-STAT3在慢性哮喘小鼠肺组织的表达及使用JAK通路抑制剂AG490干预后的表达变化用western blot及免疫组化方法检测小鼠肺组织p-STAT3蛋白表达,用荧光定量PCR检测肺组织STAT3的表达；观察哮喘小鼠使用了AG490干预后p-STAT3的表达的变化,观察小鼠气道炎症的改变及气道重塑指标的变化。5、使用地塞米松药物干预后气道重塑的改变及IL-21、IL-21R、p-STAT3的表达变化用IPP6.0图像分析软件分析地塞米松干预组小鼠气道壁厚度(WAt/Pbm)、平滑肌厚度(WAm/Pbm),免疫组化法及western blot法检测地塞米松组IL-21、 IL-21R、p-STAT3蛋白在肺组织中的表达,采用荧光定量PCR法检测IL-21mRNA、IL-21RmRNA的表达。6、统计学处理数据用x±s表示,经SPSS16.0统计软件进行统计分析。两样本均数比较采用两独立样本t检验,多组间比较采用单因素方差分析,多组样本均数两两比较,方差齐者用Bonferroni检验,方差不齐者用Dunnett’s T3法检验；两变量的相关分析采用Bivariate过程的等级Pearson相关法。P<0.05为差异有统计学意义。研究结果1、44只小鼠全部存活,OVA致敏激发后,成功建立了慢性哮喘小鼠模型。对照组小鼠雾化后无明显异常反应,哮喘组小鼠激发后,出现烦躁不安、呼吸急促、腹肌抽搐、二便失禁等症状,用听诊器听诊可闻及哮鸣音。地塞米松组及AG490组症状相似,但程度明显减轻。肺组织HE染色镜下所见符合哮喘的病理学特征,哮喘组小鼠细支气管及伴行血管周围大量炎症细胞浸润,气道壁和肺组织中可见以嗜酸性粒细胞、淋巴细胞为主的炎症细胞浸润,支气管管壁增厚、管腔狭窄,支气管管腔内可见粘液栓。2、免疫组化法结果表明哮喘小鼠同对照组小鼠肺组织均有IL-21、IL-21R的表达,哮喘组的表达较对照组表达增强(P<0.05),与western blot检测结果一致；荧光定量PCR法检测结果同样显示哮喘组小鼠IL-21mRNA、IL-21RmRNA表达较对照组增强(P<0.05)。反应哮喘组小鼠气道重塑指标的WAm/Pbm、 WAt/Pbm较对照组增加(P<0.05)。3、哮喘组、AG490组、地塞米松组小鼠肺泡灌洗液中细胞总数、中性粒细胞、嗜酸粒细胞和淋巴细胞计数均较正常对照组明显增多(P<0.01);地塞米松治疗组与哮喘组相比,细胞总数、中性粒细胞、嗜酸粒细胞和淋巴细胞计数明显减少(P<0.01),AG490组上述指标较哮喘组也有所下降(P<0.05)；地塞米松组肺泡灌洗液中细胞总数及嗜酸性粒细胞、淋巴细胞、中性粒细胞计数低于AG490组(P<0.05)。4、免疫组化及western blot分析显示对照组几乎无p-STAT3蛋白表达,哮喘组小鼠肺组织p-STAT3蛋白表达较对照组增加(P<0.05),AG490组小鼠肺组织p-STAT3蛋白表达较哮喘组减弱(P<0.05)；荧光定量PCR显示哮喘组、AG490组小鼠肺组织STAT3mRNA较对照组增加(P<0.05),两组相比,无明显差异(P>0.05)。5、地塞米松组小鼠气道重构指标WAm/Pbm、WAt/Pbm高于对照组(P<0.05),低于哮喘组(P<0.05)。Western blot法检测地塞米松组IL-21、IL-21R、 p-STAT3在肺组织中的表达较哮喘组下降(P<0.05)；AG490组小鼠IL-21的表达较哮喘组下降(P<0.05),与地塞米松组相比无统计学意义(P>0.05),AG490组小鼠肺组织p-STAT3的表达与地塞米松组相比,无统计学意义(P>0.05);AG490组小鼠肺组织STAT3mRNA的含量较对照增加(P<0.05),但与哮喘组小鼠相比,无统计学意义(P>0.05)。6、相关性分析结果：用western blot法测定IL-21蛋白、IL-21R蛋白、p-STAT3蛋白,结果表明上述指标与小鼠肺泡灌洗液中细胞总数、嗜酸性粒细胞计数均呈正相关(r>0.5, p<0.01);IL-21、IL-21R、p-STAT3的蛋白表达量与小鼠气道重构指标WAm/Pbm、WAt/Pbm均呈正相关(r>0.5,p<0.01)。研究结论IL-21主要通过JAK-STAT途径传递信号,本实验首先用不同实验方法观察了IL-21及其受体在正常对照组及哮喘模型组小鼠肺组织中的表达,观察了总STAT3及活化后的形式p-STAT3在小鼠肺组织中的表达,在建立慢性哮喘小鼠动物模型基础上,使用JAK通路抑制剂AG490及地塞米松干预后观察上述指标的变化。得出以下结论：1、IL-21及其受体在小鼠肺组织中有表达,哮喘小鼠肺组织的表达较对照组增高,IL-21在哮喘发病中是重要的促炎因子,IL-21与受体结合参与慢性哮喘小鼠发病,并参与了气道重塑过程；2、STAT3及活化后的STAT3参与了哮喘发病,可能影响了气道重塑：3、哮喘模型经AG490作用后STAT3的活化程度降低,气道炎症及重塑程度减轻,其疗效与地塞米松大致相当。4、IL—21通过激活STAT3信号通路参与了哮喘疾病的发生,地塞米松下调了IL-21及其受体的表达,抑制了肺组织STAT3的活化,减轻了气道炎症和气道重塑,IL-21/STAT3信号转导通路可能为地塞米松治疗哮喘的作用靶点之一。