【摘 要】
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微滴式数字PCR是在传统PCR技术基础上发展起来的第三代技术,该技术主要是经过聚合酶链式反应,通过对微滴图像的识别和检测来对核酸分子进行精确的定量,也就是绝对定量。但是在对荧光图像进行处理时,由于存在荧光微滴亮度分布不均匀、微滴之间连接紧密、微滴过小以及气泡等问题,导致微滴识别的难度增大,从而造成微滴数目统计不准确。为了解决微滴式数字PCR中微滴识别与数目统计的问题,本论文对微滴荧光图像进行了相关
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微滴式数字PCR是在传统PCR技术基础上发展起来的第三代技术,该技术主要是经过聚合酶链式反应,通过对微滴图像的识别和检测来对核酸分子进行精确的定量,也就是绝对定量。但是在对荧光图像进行处理时,由于存在荧光微滴亮度分布不均匀、微滴之间连接紧密、微滴过小以及气泡等问题,导致微滴识别的难度增大,从而造成微滴数目统计不准确。为了解决微滴式数字PCR中微滴识别与数目统计的问题,本论文对微滴荧光图像进行了相关研究,具体研究内容和成果包括以下几个方面:（1）图像处理的第一步是进行图像预处理,由于显微镜在拍摄微滴图像时存在噪声以及部分图像边缘部分亮度较暗,直接对采集的图像进行灰度化、图像分割等操作会导致分割后的微滴图像中存在过多的噪声,这样得到分割后的微滴图像的轮廓会比较模糊。故分别采用中值滤波、均值滤波和高斯滤波对图像进行预处理并分别计算滤波处理后的信噪比,从而获得高质量的荧光图像;对于边缘区域亮度较低的图像采用限制对比度的自适应直方图均衡化进行一定程度地增强处理。（2）对预处理后的微滴图像采用基于K均值聚类的图像分割算法进行处理,并对分割后的图像进行形态学优化和距离变换处理,再对微滴进行轮廓识别并绘制最小外接圆,最后通过外接圆的面积筛选出符合要求的微滴后进行数目统计。对于明场中亮度分布均匀并且不存在重叠微滴的图像的微滴识别准确高达99.0%,图像处理时间小于3.0s。但是此方法不适用于暗场中发荧光的图像。（3）对预处理后的图像采用自适应阈值算法及形态学优化处理,再对处理后的图像进行轮廓识别和最小外接圆绘制,最后进行微滴数目统计时,对于暗场中发荧光的微滴识别的准确率高达91%,对于明场中未发生荧光反应的微滴识别的准确率高达98%,图像处理时间均小于3.0s。（4）对预处理后的图像采用自适应阈值与欧式距离变换结合的算法进行处理,再对图像进行形态学优化处理,最后进行微滴数目统计时,对于暗场中发生荧光反应的微滴识别准确率高达95%,对于明场中的非荧光微滴识别准确率高达99%,图像处理时间也均小于3.0s。总之,本论文采用了K均值聚类算法、自适应阈值算法、自适应阈值和距离变换结合的算法对PCR微滴的暗场荧光图像和明场图像进行了分割和计数处理。研究结果表明,采用自适应阈值算法以及欧式距离变换对微滴图像进行处理和微滴计数,对荧光微滴和未发生荧光反应的微滴统计结果的准确率都比较高。此结果对数字PCR的微滴识别具有重要意义,能为数字PCR产品的研发提供一定的理论支持。
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