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背景:精子冷冻保存是精子库的核心业务,包括志愿者精子冷冻保存和自体精子冷冻保存。前者是我国精子库的主要业务,而自体精子冷冻保存业务也逐渐受到重视。目的:评估我国男性生育力保存的现状,为减少肿瘤患者精子冷冻损伤提供建议方案。并研究精子冷冻损伤的相关机制,探寻改善冷冻复苏后精子质量的方法。方法:首先,我们回顾性分析了我们精子库自体精液冻存的相关数据,并比较了不同肿瘤患者在肿瘤治疗前精液参数的差异。机制研究部分,采用电镜、激光共聚焦、流式细胞术等方法检测精子冷冻复苏后线粒体结构和相关功能的改变。此外,采用数据非依赖采集的定量蛋白质组学和靶向代谢组学的方法,筛选冷冻复苏后精子的差异蛋白质和代谢物。随后,在前期研究结果的基础上,选取能量物质-左卡尼汀(LC)。探索其作为冷冻保护添加剂,对人冻存精子功能的影响。结果:10年来(2006年7月至2017年12月),共有295位患者在我中心成功进行了自体精液冻存。在所有自体精液冷冻保存患者中,疾病及相关治疗的人数最多,共186人,占总人数63.1%。共有20名男性患者申请使用冻存精液,共接受43个周期辅助生殖技术治疗,最终16例婴儿成功分娩。肉瘤和白血病患者的精子总数、精子活力明显降低。睾丸肿瘤患者精子总数下降明显,但活力与对照组未见明显差异。睾丸肿瘤和白血病患者的精子复苏率降低明显。冻存复苏后精子线粒体结构疏松、线粒体嵴增宽,且部分呈空泡样改变;精子线粒体膜电位降低(MMP),能量生成减少(ATP);mtDNA拷贝数增加但完整性未见明显差异;而线粒体凋亡途径基因表达增多(Bax增加,Bcl-2减少)。其次,我们发现174个明显失调的蛋白质(上调蛋白质数76个,下调蛋白质数98个)和16个差异表达代谢物(9种代谢物上调,7种代谢物下调)。通过KEGG分析,焦距至糖代谢通路。与新鲜精子配对比较显示:6-磷酸葡萄糖异构酶(Glucose-6-phosphate isomerase,GPI),乳糖脱氢酶-B(Lactate Dehydrogenase B,LDHB),乙醇脱氢酶5(Alcohol Dehydrogenase 5,ADH5)和磷酸甘油酸变位酶1(Phosphoglyceratemutase1,PGAM1)四个糖酵解相关蛋白差异表达;L-乳酸、磷酸烯醇丙酮酸、D-葡萄糖和二羟丙酮磷酸盐4个糖酵解相关代谢物存在差异。最后,LC添加到冷冻保护剂可以改善冷冻复苏后精子活力和运动参数,减少冷冻损伤对于精子质膜和核DNA的完整性的破坏,但是对于精子顶体完整性无明显保护作用。LC可能通过抗氧化的作用,保护精子线粒体的功能(升高MMP),减少ROS产生,增加ATP的产生;此外,LC可能通过参与乳酸和丙酮酸的调节,改善精子活力。结论:1.精子冷冻保存是男性生育力保存的有效方式。睾丸肿瘤、白血病和肉瘤会降低精液质量。2.冷冻复苏过程会导致精子线粒体结构紊乱和功能障碍。3.冷冻损伤会引起精子蛋白质和代谢物差异表达;通过生物信息学结果和蛋白验证提示:冷冻复苏过程会导致精子糖酵解功能紊乱。4.左卡尼汀作为冷冻保护添加剂,可以改善冷冻复苏后精子功能。