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背景:胃癌是消化系统中常见的一种恶性肿瘤,其恶性度高,预后差,给人民群众的身体健康带来了极大的危害。胃癌在我国发病率远高于欧美国家。随着辅助化疗的应用,以及新型靶向药物的研发,胃癌病人的短期预后有所改善,但化疗药物以及靶向药物在治疗过程中常发生耐药情况,导致胃癌的病人长期预后并不理想。因此,胃癌的生物学机制研究对于新型药物的研究和新治疗靶点的开发都显得尤为重要。铁死亡这一新型程序性死亡在多种疾病的发生、发展中起到关键作用,在胃癌领域更是被广泛的研究,并取得一定进展。Anoctamins（ANO）,也称为TMEM16蛋白,参与多种细胞膜功能,包括离子转运,促进脂质在质膜双层中的双向重新分布和对其他膜蛋白的调节。其中,ANO6（TMEM16F）是TMEM16蛋白家族成员之一,具有独特的功能,是磷脂酰丝氨酸从质膜内叶到外小叶易位过程的主要贡献者。有研究表明,ANO6的激活是细胞铁死亡的关键步骤,这一发现明确了ANO6在铁死亡过程中的重要作用。而ANO6在胃癌铁死亡机制中尚未有明确的研究。通过对铁死亡在胃癌领域的进一步研究有望找到新的胃癌治疗靶点。目的:本研究旨在通过研究ANO6在胃癌铁死亡过程中所扮演的角色以及可能的分子机制,为胃癌的诊治提供新的治疗靶点和理论依据。方法:1、利用TCGA、GEO、HPA数据库,最终筛选得出目的基因ANO6。分析预测在胃癌组织中癌和癌旁组织中ANO6的差异表达与胃癌患者预后的关联。利用TCGA-STAD数据集对目的基因表型预测,研究ANO6表达水平与胃癌患者性别、肿瘤TNM分期、肿瘤分级、及预后的相关性。通过Western blot、免疫组化验证ANO6在胃癌临床样本中的表达情况,验证生物信息学分析的结果。2、使用人胃癌细胞系（AGS、MGC-803、HGC-27、MKN-45、BGC-823）,通过Western blot技术检测ANO6表达水平,根据表达水平建立过表达及敲低稳定株。通过q PCR检测细胞转染效率。通过平板克隆、CCK-8及Ed U实验对胃癌稳定过表达及敲低细胞株增殖能力进行检测。通过裸鼠皮下荷瘤实验,研究ANO6对胃癌细胞增殖的影响。通过免疫组化对皮下荷瘤进行染色,研究ANO6对胃癌细胞增殖能力的影响。3、通过GSEA预测ANO6相关通路和潜在的下游基因。通过CalceinAM/PI双染色技术、MDA检测、透射电镜研究ANO6差异性表达对胃癌细胞铁死亡的影响。4、确定ANO6下游基因后,通过Western blot等技术研究ANO6参与胃癌肿瘤相关表型及铁死亡过程所介导的下游通路。5、构建潜在下游基因ACSL4过表达质粒（ACSL4）和ACSL4敲低质粒（sh ACSL4）,利用Western blot、CCK-8、平板克隆、MDA检测、Ed U实验回复上述ANO6调控胃癌铁死亡通路,进一步明确ANO6与ACSL4表达水平之间关系以及对胃癌细胞增殖及铁死亡敏感性的影响。6、通过Western blot和免疫组化技术,对45例临床胃癌病人手术切除肿瘤组织样本中ACSL4和ANO6表达水平进行检测,验证表达水平相关性。最后通过TCGA数据库预测下游基因ACSL4差异表达对胃癌患者预后的影响。结果:1、通过TCGA数据库对目的基因表型预测,结果显示ANO6的表达水平与胃癌肿瘤分期、肿瘤分级、肿瘤浸润深度密切相关,与胃癌患者性别、淋巴结转移、远处转移转移无关。ANO6高表达提示更强的胃癌增殖能力,且病人的预后更差。2、建立ANO6敲低及过表达细胞系,通过平板克隆、CCK-8、Ed U染色实验表明ANO6高表达可以促进胃癌细胞增殖,而低表达可以抑制胃癌细胞增殖。通过裸鼠皮下荷瘤、免疫组化检测增殖能力（Ki67）,结果表明,ANO6过表达显著促进胃癌细胞在体内生长和增殖能力,而敲低ANO6可以抑制胃癌细胞在体内的生长和增殖能力。上述结果表明,ANO6可以在体外及体内抑制胃癌细胞增殖。3、通过生信分析发现,ANO6表达上调与促癌通路相关。结合国内外最新研究成果通过Western blot对铁死亡经典通路检测发现ANO6与ACSL4表达呈负相关。构建ACSL4过表达质粒和敲低质粒,并进行下游回复实验。通过Western blot研究胃癌细胞中ACSL4是否会影响ANO6的表达,结果表明,改变ACSL4表达水平ANO6表达水平无明显变化。利用CCK-8、集落形成实验研究ACSL4对胃癌细胞增殖能力的影响,结果表明,ACSL4表达水平与胃癌细胞增殖能力呈正相关。4、通过Calcein-AM/PI双染实验、药物对比实验、MDA检测实验、透射电镜实验表明,ANO6可能通过调节ACSL4通路影响胃癌细胞的铁死亡;ANO6高表达能够抑制胃癌细胞铁死亡并促进胃癌的增殖,ANO6低表达能够促进胃癌细胞铁死亡过程并抑制胃癌的增殖。通过向稳转细胞系中加入铁死亡激活剂（Erastin）进行Ed U实验、MDA检测,研究ACSL4对胃癌细胞铁死亡的影响,结果表明,ACSL4高表达促进胃癌细胞铁死亡。上述结果表明,ACSL4促进胃癌细胞铁死亡,从而抑制胃癌细胞增殖。5、本研究前述工作推测ANO6可能通过ACSL4影响胃癌的铁死亡过程,结合国内外最新研究,ANO6可以影响p-AKT（AKT磷酸化）,而p-AKT可以影响ACSL4水平的变化。通过Western blot对ANO6、ACSL4、p-AKT水平进行检测,初步研究其关系。再加入AKT磷酸化抑制剂（AZD5363）,进一步验证其表达水平之间的作用关系。确定ANO6是通过p-AKT来调控ACSL4水平。6、临床组织标本进行Western blot实验对ACSL4表达水平进行检测,结果证实ACSL4在胃癌组织中低表达。对临床组织标本进行ANO6及ACSL4免疫组化对比检测,结果表明ANO6与ACSL4在胃癌组织中的表达水平呈负相关。利用TCGA数据库进行ACSL4生存概率分析,结果显示相对于低表达组,高表达组与更佳的预后相关。结论:1.ANO6在胃癌组织中异常高表达,与患者预后不良密切相关。2.过表达ANO6可以促进胃癌细胞在体内及体外的增殖能力。3.ANO6通过上调p-AKT抑制ACSL4表达进而抑制胃癌铁死亡过程,从而促进胃癌的增殖。