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巴贝斯虫病是由巴贝斯虫引起的一种血液寄生虫病，主要通过硬蜱传播，会引起人和宿主动物发热、贫血、血尿，甚至死亡。田鼠巴贝斯虫（Babesia.microti）是最重要的人兽共患巴贝斯虫之一，严重危害人类健康，所以巴贝斯虫的防治工作显得尤为重要。半胱氨酸蛋白酶（Cysteine protease）是在酶活性中心含有半胱氨酸残基的蛋白水解酶，属于木瓜蛋白酶家族，它的分布范围很广，从病毒到脊椎动物的生物体。寄生虫半胱氨酸蛋白酶大多属于木瓜蛋白酶样蛋白酶（Papain like protease）（CA族）内的C1族（组织蛋白酶B、组织蛋白酶L）和C2族（钙激活蛋白酶样蛋白酶）。组织蛋白酶E（Cathepsin E）是主要的细胞内天冬氨酸蛋白酶，主要存在于免疫系统的细胞中，涉及MHC II类途径介导的抗原加工。有研究表明，Cathepsin E在感染晚期阶段有助于寄生虫的清除。这些蛋白酶在寄生虫的生存和发育中起着重要的作用，是关键的药物靶标。本研究针对田鼠巴贝斯虫半胱氨酸蛋白酶和组织蛋白酶E进行了探索性研究。同时，探索了田鼠巴贝斯虫半胱氨酸蛋白酶与蜱体分离的半胱氨酸抑制分子（Cystatin分子）的互作关系。 通过对田鼠巴贝斯虫转录组测序结果进行分析，筛选出在田鼠巴贝斯虫发育和生存中有重要作用的木瓜蛋白酶样半胱氨酸蛋白酶以及组织蛋白酶E。筛选出的半胱氨酸蛋白酶基因，命名为BmCYP，大小为1418 bp，包含一个大小为1338 bp的开放阅读框，编码445个氨基酸，预测蛋白分子量为49.7 kDa，等电点为8.48，无信号肽序列，预测蛋白的酶活性中心（-QGACGSCWAFAT和SM HAV LL VGYG-），正是BmCYP具有催化活性的结构域。筛选的组织蛋白酶E基因命名为BmCATEB，开放阅读框大小为1440 bp，编码449个氨基酸，预测蛋白分子量为53.4 kDa，等电点为6.11，也无信号肽，预测蛋白的酶活性中心为AAVDTGSSLITT。将两基因分别克隆到pET28a质粒中，然后转化到表达菌E.coli BL21，经IPTG诱导蛋白表达，用Ni-NTA树脂纯化蛋白。Western Blot结果发现，His单抗均可识别重组蛋白。酶活性分析表明，BmCYP与BmCATEB分别具有半胱氨酸蛋白酶和组织蛋白酶E的活性。镰形扇头蜱的Cystatin分子RHcyst-1和RHcyst-2在感染与未感染巴贝斯虫蜱体内的基因表达量分析表明，在半饱血若蜱阶段，RHcyst-1和RHcyst-2基因显著上调，在饱血若蜱及蜕皮后的成蜱阶段，基因显著下调。此外，蜱的半胱氨酸蛋白酶抑制分子能有效抑制巴贝斯虫的半胱氨酸蛋白酶的活性，且对组织蛋白酶E也有一定的抑制。 综上所述，本研究分离鉴定了田鼠巴贝斯虫的两个蛋白酶分子BmCYP与BmCATEB，结果显示两重组蛋白均具有蛋白酶活性。巴贝斯虫感染蜱后，引起蜱的RHcyst-1和RHcyst-2分子显著变化，体外实验表明蜱的半胱氨酸蛋白酶抑制分子可抑制巴贝斯虫的半胱氨酸蛋白酶，提供了原虫与媒介互作的证据。这些研究结果对阐明蜱与原虫互作机制具有重要意义。