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猪链球菌(Streptococcus suis,S.suis)是重要人兽共患病病原菌,可使猪或人感染引发多种疾病。其中2型猪链球菌(S.suis 2)致病性最强,可使人感染患脑膜炎、败血症、心内膜炎甚至中毒性休克综合征。病原菌在宿主体内分裂增殖是其致病基础,其中细胞分裂蛋白DivIVA是控制细胞分裂的端部锚定蛋白,参与细胞分裂位点的选择与新生肽聚糖的合成。在肺炎链球菌中DivIVA蛋白功能的缺失导致细胞分裂缺陷,致病性减弱;在S.suis2中尚无细胞分裂机制相关研究报道。课题组在中国强毒株05ZYH33全基因组测序及功能注释的基础上,发现编码DivIVA蛋白的同源基因05SSU0487,生物信息学对该基因进一步分析发现其可能参与细胞分裂调控。因此本文主要通过原核表达技术获得DivIVA重组蛋白并制备多克隆抗体,通过构建divIVA基因突变株分析其在S.suis 2中生物学功能及其对致病性的影响,主要研究结果如下:1.DivIVA蛋白编码基因05SSU0487生物信息学分析对05SSU0487生物信息学分析发现,该基因由687个核苷酸组成,可能编码形成一个无信号肽、无跨膜区的胞内蛋白分子,该蛋白与肺炎链球菌DivIVA序列像似性为67%,具典型的DivIVA蛋白结构域,二级结构以α螺旋为主。2.DivIVA蛋白原核表达及多克隆抗体制备根据divIVA基因核苷酸序列设计PCR扩增引物,扩增目的片段,构建的pET28a-divIVA表达质粒经诱导、纯化获得DivIVA蛋白,免疫新西兰兔,制备兔多克隆抗体,效价达1:409600,该抗体与DivIVA蛋白特异性结合。3.ΔdivIVA基因突变株的构建为研究divIVA基因生物学功能,设计引物PCR扩增divIVA基因上、下游同源臂以及Spc抗性基因片段,依次连入pUC18质粒,构建pUC18::divIVA质粒,电转化S.suis2感受态细胞,筛选同源重组双交换突变株。经组合PCR、RT-PCR及测序验证正确后,将突变株定名为ΔdivIVA。4.ΔdivIVA突变株细胞表型、生物学特性及致病性研究在构建ΔdivIVA突变株的基础上,观察ΔdivIVA细胞发现其表型发生明显变化,如荚膜变薄,细胞形态畸形,隔膜异常导致细胞聚集;生物学特性研究表明,ΔdivIVA菌株生长速率减慢,菌落直径变小,抗氧化能力减弱;体外细胞实验表明,ΔdivIVA菌株对Hep-2细胞的黏附能力增强,对小鼠巨噬细胞(Raw264.7)的抗吞噬能力减弱,对人中性粒细胞(PMNs)的抗吞噬能力减弱;动物感染实验表明,ΔdivIVA菌株对BALB/c小鼠无致病性。综上表明,在S.suis 2中divIVA基因对细菌生长、细胞表型及致病性具有重要影响,该基因的缺失导致细菌生长缓慢,细胞分裂缺陷,对小鼠致病性减弱等;原核表达获得DivIVA蛋白并制备兔多克隆抗体为后续蛋白功能研究奠定基础。