复发和转移仍是导致结直肠癌患者死亡的主要原因。随着基础临床研究的不断深入,循环肿瘤细胞（Circulating Tumor Cell,CTC）在结直肠癌转移复发中的作用越来越引起人们的重视。目前研究已证实CTC与实体瘤的复发和转移具有较高的相关性,也是影响患者生存期的独立预后因素。上皮间质转化（Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT）作为重要的生理病理过程,在恶性肿瘤转移、复发和耐药中起着十分重要的作用,不仅是CTC形成的重要机制,也是目前CTC研究的这个重要方向。因此,动态监测CTC及EMT-CTC的变化,能够为肿瘤复发和预后评价提供重要的依据;而对EMT发生机制的研究,则能为CTC临床应用提供重要的科学依据。外泌体（Exosomes）作为一种新型的细胞间通讯模式受到了广泛的关注。Exosomes体是活性细胞释放到胞外基质中的一类直径约为30-200nm的膜性囊泡,分布和来源广泛,携带有蛋白和遗传载体等生物活性分子,是一种重要的胞间物质和信息交流的工具。肿瘤来源exosomes通过传递蛋白、微小RNA（microRNA,miRNA）、长链非编码 RNA（Long Non-coding RNA,LncRNA）对微环境中的肿瘤细胞进行调控,实现EMT表型的传递。microRNA（miRNA）作为一类非编码RNAs,是exosomes生物学功能的重要组成部分,越来越多的证据表明其在肿瘤中EMT的作用,能够影响肿瘤侵袭转移的能力。因此本课题从临床出发,首先探讨CTC数目变化在结直肠癌中的预后价值;接下来进一步探讨不同表型即发生EMT的CTC（MCTC）和上皮表型CTC（ECTC）在结直肠癌中的预后价值。最后,我门探讨exosomes 在传递EMT表型的作用,主要分为以下两个方面:1.建立稳定的发生EMT结直肠癌细胞,提取鉴定exosomes,研究EMT细胞exosomes对结直肠癌生物学行为的影响。2.通过测序及生物信息学分析筛选出exosomes内miR-148a-3p,进一步研究miR-148a-3p对结直肠癌生物学行为的影响及其靶点基因的预测和验证。本课题主要包括以下三部分:第一部分 循环肿瘤细胞数目变化在结直肠癌中的预后价值的探究目的:循环肿瘤细胞（CTC）已被认为是评估结直肠癌（CRC）预后的参考指标之一,然而,根治性切除后术CTC的预后价值仍不清楚。本研究旨在比较根治性切除术前及术后的CTC在CRC中的预后价值。方法:收集定2014年至2015年接受根治性切除术前和术后的外周血,并通过ISET device-CTCBIOPSY（?）检测CTC。根据患者术前和术后CTC的状态（即CTC检出阴性和阳性）,将纳入患者分为4个队列:术前和术后CTC-;术前CTC-而术后CTC+;术前CTC+而术后CTC-;以及术前和术后CTC+;分析四组患者的3年无复发生存率（RFS）。结果:研究结果显示:术前CTC+的3年RFS率（86.2%）高于术前CTC-组（67.0%）（P=0.038）。术后 CTC+的 3 年 RFS 率（57.1%）比术后 CTC-（82.7%）低（P=0.001）。此外,术前和术后CTC+的患者3年RFS率（53.8%）低于术前CTC+而术后CTC-患者（78.9%）低（P=0.004）。Cox回归分析证实术后 CTC+（HR=2.82,95%CI:1.39-5.75,P=0.004）是 3 年 RFS 率低的独立因素。结论:术后CTC+患者的复发风险高于术前CTC+,术后CTC+是CRC患者不良预后的独立因素。因此术后CTC的检测对于CRC患者预后价值更高。第二部分 循环肿瘤细胞表型变化在结直肠的预后价值探究目的:循环肿瘤细胞（CTC）是由上皮表型和间质表型的不同亚群组成的,然而这些不同亚型CTC在结直肠癌（CRC）治疗前以及治疗后的预后价值仍不清楚。本部分旨在研究CTC的上皮表型和间质表型变化在结直肠癌中预后价值。方法:本研究主要是采用肿瘤细胞大小的膜过滤方法富集CTC,免疫细胞化学染色方法对CTC的上皮/间质表型鉴定,并对89例结直肠癌患者治疗前和治疗后上皮表型CTC（即ECTC）和间质表型CTC（即MCTC）变化进行回顾性分析,研究治疗前后ECTC 和MCTC的预后价值。结果:治疗过程中ECTC的检出率在减少,MCTC检出率变化不大。无论治疗前,还是治疗后ECTC+和MCTC+都与患者的RFS相关;进一步分析发现,治疗前后的ECTC+组的RFS中位时间为25.6个月明显高于治疗前后MCTC+组的RFS中位时间为18.1个月(P<0.001=。结论:结直肠癌患者外周血同时存在上皮型和间质型CTC。间质表型CTC检测对鉴别高危复发人群有更高的价值。第三部分:Exosomes源miR-148a-3p介导的上皮间质化在结直肠癌侵袭转移中的机制研究目的:基于前部分的研究发现MCTC检测更具有临床意义。CTC定义为来源于原发灶或转移灶,获得脱离基底膜的能力并入侵穿过组织基质进入血管的肿瘤细胞。因此,我们进一步对CTC来源的肿瘤组织样本EMT表型分析发现癌组织中侵袭前缘与中心（癌巢）EMT程度是不同的,而在MCTC组织中侵袭前缘EMT更加显著。目前,多项研究证实在肿瘤组织中EMT的空间异质性与肿瘤的微环境密切相关,而exosomes做为肿瘤微环境的重要组成部分,其在EMT中的作用也越来越引起研究者的关注,本部分我们将从肿瘤微环境出发,以外泌体为切入点,对肿瘤组织中EMT空间异质性的机制进行初步的探索研究。方法:对56例治疗前ECTC和MCTC阳性患者进行E-cadherin和Vimentin免疫组化染色,评估其侵袭前缘与癌巢EMT程度,并分析其与ECTC和MCTC阳性检出的相关关系。然后通过IL6处理上皮型大肠癌细胞系HCT116,建立HCT116 EMT模型。分别从正常培养上清中提取exosomes（E-exo）和发生EMT的HCT116上清中提取exosomes（M-exo）,分别加入正常培养的HCT116中,通过检测结直肠癌细胞的增转移和侵袭方面的变化来反映M-exo在人结直肠癌中的功能。使用Illumina HiSeq 2500高通量测序（miRNA-seq）对E-exo和M-exo中的miRNA表达谱进行分析,确定了 miR-148a-3p在M-exo中存在上调,接下来的实验中我们将通过生物信息学网站对miR-148a-3p靶标进行了预测,并通过一系列的实验进行了验证。结果:1.MCTC阳性患者侵袭前缘的EMT表型更加显著。2.IL6诱导HCT116后可以使HCT116细胞形态发生形改变,WB结果显示,IL6可以诱导HVT116发生EMT。3.投射电镜及WB结果提示,超速离心提取exosomes呈杯口样,直径50-200nm,通过WB进一步验证exosomes上特定表达的蛋白。4.划线实验和Transwell显示M-exo加入HCT116中后,可以提高HCT116的迁移和侵袭能力。5.WB结果显示M-exo能够诱导HCT116发生EMT。6.Transwell实验和划痕实验结果显示,上调miRNA-148a-3p表达后,HCT116细胞侵袭能力显著增强。下调miRNA-148a-3p表达后,E-exo诱导HCT116细胞侵袭能力减弱。7.上调miR-148a-3p能够诱导细胞发生EMT。WB及qPCR显示细胞中miR-148a-3p与PTEN表达呈负相关,提示PTEN可能是miR-148a-3p的下游靶基因基因结论:肿瘤组织样本EMT表型分析发现癌组织中侵袭前缘与中心（癌巢）EMT程度是不同的,而在MCTC组织中侵袭前缘EMT更加显著。IL6可以诱导细胞发生EMT;M-exo能够提高HCT116的侵袭和迁移能力并诱导EMT的发生;M-exo中存在miR-148a-3p的上调,同时上调miR-148a-3p能够诱导细胞发生EMT;细胞中miR-148a-3p与PTEN表达呈负相关,提示PTEN可能是miR-148a-3p的下游靶基因基因。