论文部分内容阅读
蛋白质性质的丝氨酸蛋白酶抑制剂广泛地分布于各种植物中,尤其是种子中。它们对植物病原真菌和食草昆虫都具有广谱的抗性。本研究采用离子交换层析、亲和层析和离心超滤等分离纯化方法,从苦荞麦种子中分离出一种胰蛋白酶抑制剂((FtTI)。FtTI在还原和非还原条件下电泳都表现出单一的条带,用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳对纯化产物进行分析得出,FtTI的近似分子量大约为14.0 kD。对其性质研究表明：FtTI对胰蛋白酶有较强的抑制作用,FtTI对胰蛋白酶的摩尔抑制比为1：1,迪克森作图法显示,该抑制剂属竞争性抑制类型,该抑制剂对牛胰蛋白酶的抑制常数为1.6 nM(以BApNA为底物)。Edman降解法测序显示,FtTI的N末端氨基酸序列为V-G-K-Q-S-W-P-E-L-V,与甜荞麦的胰蛋白酶抑制剂N端序列有80%相似性,这表明FtTI与荞麦属的其它蛋白酶抑制剂具有很高的同源性。FtTI在20-80℃条件下具有较高的热稳定性,在80℃处理30 min后可保留84%左右的抑制活性。FtTI在强酸性和强碱环境下都较为稳定,FtTI的最适pH值为8.0,在pH3.0-10.0条件下,能保持90%以上的抑制活性。高温高压条件下,FtTI很快被钝化,FtTI在0.198/120 MPa/℃和0.143/110MPa/℃条件下,作用20 min分别失去其抑制活性的97%和93%。而超声波对FtTI的钝化作用却与其振幅及作用时间成正比。根据荞麦胰蛋白酶抑制剂氨基酸的保守序列设计简并引物,PCR扩增出苦荞麦胰蛋白酶抑制剂基因(FtTI)的保守序列,然后以苦荞麦DNA为模板,采用染色体步移技术扩增出该基因的5’末端,再以苦荞麦cDNA为模板采用3’RACE技术,扩增FtTI基因的3’末端,最后通过CExpress软件拼接得到了FtTI基因的全长序列,它的基因全长为644 bp,含有一个264 bp的完整开放阅读框,编码87个氨基酸,具有植物丝氨酸蛋白酶抑制剂超家族的典型特征,即在N-端有保守的WPELVG区,中部有保守的XENXXV区,C-末端有保守的RCDRV区。Blast蛋白质序列比对分析表明,苦荞麦胰蛋白酶抑制剂与蓖麻子(Ricinus communis) XM 002520961. 1、接骨木(Sambucus nigra) Z46949.1、与麻风树(Jatropha curcas) FJ906844.1、龙葵(Solanum nigrum) ADP05502.1、百日草(Zinnia violacea) AB091073.1、丹参(Salvia miltiorrhiza) EF187459.1、甜荞(Fagopyrum esculentum) AAB46906.1和马铃薯(Solanum tuberosum) AAS46024.1等的丝氨酸蛋白酶抑制剂的同源性分别为：67.8%、66.6%、65.5%、64.3%、643%、60.1%、59.7%和54.7%。上述结果表明,已成功获得了苦荞麦FtTI基因。FtTI分子中含有87氨基酸残基,利用ClustalW程序软件进行多重序列比对发现,FtTI有两对二硫键分别为Cys8-Cys65和Cys49-Cys58,活性位点为Arg67-Val68,氨基酸序列比对分析表明,FtTI属于蛋白酶抑制剂Ⅰ家族。将FtTL基因插入到表达载体pPIC9K中,构建重组表达载体pPIC9K-rFttI,并转化至巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)GS 115中高效表达,经过MD平板筛选和蛋白酶抑制活性测定,证明获得了高效表达的转化子GS115-FtTIⅦ。在摇瓶培养条件下,利用单因素试验和响应面中心组合设计对酵母工程菌表达条件进行了优化,得到了最适的诱导表达条件,即发酵量5%-15%、甲醇含量0.25%-0.75%和诱导时间在2.5-3.5d时,对rFtTI的表达最为有利,该重组蛋白质在摇瓶内的表达量为489.6-527.4 U/mg。该重组表达蛋白质经亲和层析和离心超滤两步纯化后,通过SDS-PAGE电泳检测,其分子质量大约13.8 kDa。从1L发酵液总共能够得到287 mg重组蛋白,表达量为527.4 U/mg。纯化后的rFtTI能有效地抑制胰蛋白酶的活性,以苯甲酰-DL-精氨酰-对硝基苯胺(BApNA)为底物,迪克森作图法分析显示,对牛胰蛋白酶的抑制常数为1.59 nM,该抑制剂属于竞争性抑制剂。FtTI强烈地抑制南瓜蔓枯病、佛手瓜叶枯病、番茄早疫病和辣椒炭疽病等病原真菌菌丝的生长。在5-30μg/mL条件下,FtTI几乎完全抑制南瓜蔓枯病、佛手瓜叶枯病、番茄早疫病、辣椒疫病和辣椒炭疽病等病原真菌菌丝的生长。即使在FtTI的浓度大于100μg/mL条件下,小麦赤霉病和玉蜀黍赤霉病病原真菌菌丝的生长却不受什么影响。显微镜下观察发现,与正常菌丝相比,南瓜蔓枯病、辣椒疫病、菜豆角斑病和辣椒炭疽病的菌丝变得细小,玉米大斑病菌丝产生了畸形,豇豆轮纹病的菌丝产生了顶端畸形。用含有纯化的rFtTI人工饲料饲喂甘蓝夜蛾幼虫,试验结果表明,纯化的rFtTI对甘蓝夜蛾幼虫没有生长发育抑制作用,然而,纯化的rFtTI对甘蓝夜蛾具有较强毒杀作用,其毒杀作用表现比较缓慢,在处理3d以后才开始逐渐表现出较高的毒杀作用,尽管甘蓝夜蛾取食不同浓度的rFtTI,其累计死亡率都是95%,但是随着取食rFtTI浓度的增加,其到达死亡的时间越短。