听力损失是导致言语交流障碍的常见致残性疾病,然而病因尚未完全阐明。其中,遗传性耳聋是听力损失的常见类型,相关基因的鉴定工作,自1995年第1个非综合征型耳聋基因POU3F4被克隆以来,已发现85个非综合征型耳聋基因和60余个综合征型耳聋基因(http://hereditaryhearingloss.org/)。然而,现有的耳聋基因检测集中于常见基因的常见突变,诊断率仅为30%左右,更多的遗传性耳聋无法明确病因,仍然存在很大的探索空间,有待于进一步研究。近些年来,基因组检测技术飞速发展,新一代测序技术日新月异并得以广泛的应用,其深度、精度的日益增强为遗传性耳聋基因克隆提供了前所未有的契机。外显子组测序具有通量高、速度快、价格低的显著优势,尤其适用于分析像遗传性耳聋这样的以孟德尔遗传规律传递的单基因疾病,为遗传性耳聋基因的克隆提供了高效快捷的工具。本研究立足于国家基因库聋病分库丰富的遗传性耳聋资源,将丰富的资源与高通量的技术相结合,取得了一些令人欣喜的研究成果,本研究包括如下两部分：第一部分目标区域捕获联合高通量测序在遗传性耳聋中的效能研究第一章目标区域捕获测序在已知突变耳聋家系中的效能验证目的初步建立目标区域捕获联合高通量测序技术的遗传性耳聋基因检测平台,验证该方法在遗传性耳聋基因诊断中的效能。方法设计一组遗传性耳聋基因捕获芯片对目标序列进行捕获,包括已知遗传性耳聋基因及从动物实验表明可能和遗传性耳聋相关的核基因共307个+线粒体基因全序列,选取已知致病突变的83例样本进行高通量测序及测序数据分析,找出致病突变。采用自身前后对照及双盲法对高通量测序结果与前期Sanger测序结果进行比较。结果83例已知致病突变的阳性检测样本中,总检出率为100%。其中81例样本检测结果与Sanger测序完全一致,包括GJB2, 12SrRNA, SLC26A4,POU3F4, OTOF, PJVK共6个基因47种致病突变,突变类型以错义突变和小片段插入缺失(Insert and deletion, InDel)为主；2例常染色体隐性遗传样本多检出一个变异,明确了致病原因。结论307个聋病相关基因目标区域捕获联合高通量测序是遗传性耳聋的有效诊断方法,将有效地推进遗传性耳聋基因诊断的研究进展。第二章目标区域捕获测序在未知病因耳聋家系中的应用本部分研究选取25例课题组前期经Sanger测序排除常见基因突变的耳聋家系样本,应用第一章研究内容设计的芯片进行目标区域捕获和高通量测序。其中5例检测结果为阴性,未发现阳性变异；7例临床信息完善的ADNSHL大家系中,鉴定了KCNQ4、TJP2、MYH14、MY07A等候选基因,另有两大家系检测结果为阴性；13例样本的检测结果为临床意义未明,疑似致病。本部分研究在25个家系中的5个家系中鉴定了致病候选基因,检出率为20%；13例检出临床意义未明变异的家系有待进一步家系内及人群验证,以明确致病性；7例阴性样本将进行深入表型分析,并进一步选择全外显子组测序、全基因组测序或微阵列比较基因组杂交等方法继续探索致病原因。第二部分常染色体显性遗传家系致病基因的鉴定第一章常染色体显性遗传性听力损失家系鉴定KCNQ4新突变及已知突变本研究收集到一个5代84人的常染色体显性遗传大家系727及一个6代66人的常染色体显性遗传大家系025,两家系的患者均表现为双侧对称的、进行性下降的迟发型听力损失,听力损失表型和DFNA2型听力损失一致。我们应用目标区域捕获联合高通量测序的方法对两个家系中的先证者进行测序分析,经过功能变异鉴定和频率筛选后发现候选变异。应用PCR和Sanger测序对家系成员进行候选变异的筛查,发现位于DFNA2基因座的KCNQ4基因的p.G285S突变在727家系患者均携带,而正常者均无此突变,表型和基因型共分离,p.W275R突变在025家系中共分离,这两个突变均位于保守区域,可能影响基因编码蛋白结构。其中p.G285S是已知致病突变,p.W275R突变是新突变。KCNQ4基因是电压门控式钾离子通道家族中的成员,在内耳钾离子循环中有重要作用。KCNQ4由6个跨膜区域组成(S1-S6),p.G285S与p.W275R均位于KCNQ4基因的第5和第6跨膜区之间,该区域是已经报道DFNA2型听力损失较集中的区域。本研究应用目标区域捕获联合高通量测序的策略在2个中国常染色体显性遗传的大家系中鉴定了KCNQ4基因的2个致病突变,为首次在中国人中发现的KCNQ4突变,并对该基因突变的基因型-表型进行了关联分析,为后续阐明KCNQ4致听力损失的分子机理及对迟发型听力损失的防治提供了资源。第二章TJP2基因新突变和GJB2基因复合杂合突变在一个中国常染色体显性遗传家系的鉴定本部分研究内容运用了经典的连锁分析及候选基因法,基因型-表型关联分析,候选基因筛查及目标区域捕获测序等多种方法,最终在686家系中鉴定一个常染色体显性遗传的听力损失相关基因TJP2,并明确了家系中不共分离患者的基因型为GJB2复合杂合变异。为揭示中国常染色体显性非综合征性遗传家系686的遗传密码,近10年来,我们课题组对该家系进行了连锁分析,模块化预测,基因型-表型关联分析,候选基因筛查等方法。最终通过基因型表型关联分析我们确定了可能致病的错义突变TJP2(p.G694E),该基因与凋亡和年龄相关性听力损失(age-related hearing loss, ARHL)密切相关,然而该突变在家系成员中不完全共分离。通过目标区域捕获测序,方面我们进一步验证了TJP2基因c.2081G>A,并在不共分离患者中鉴定了GJB2基因复合杂合突变(p.Y136*和p.G45E),该成员与家系中其他患者表型不一致。综之,我们在686家系中确定了同现的两种遗传原因,即TJP2致病突变及GJB2致病突变在家系中同时存在。TJP2可能致病的错义突变同时也提供了进一步调查研究ARHL的机会。此外,通过对686家系近10年的研究,我们得出的结论是没有一种技术足以解决所有ADNSHL的发病机制相关研究,因此,有必要将不同方法有效组合。