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多种内源或外源性因素如化学物质、紫外线辐射、电离辐射和活性氧等都会造成真核生物的DNA损伤。其中,对细胞毒性最强的损伤形式之一为DNA双链断裂(DSBs),它是一种两条互补DNA链的磷酸骨架同时断裂的损伤形式。为维持基因组的稳定性,生物体进化出一套精密的DNA损伤应答系统来检测并修复DNA双链断裂,其中包括非同源末端连接(non-homologous end joining,NHEJ)和同源重组(homologous recombination,HR)。同源重组保真性高,是酿酒酵母DNA双链断裂最主要的修复方式。Bdf1是BET蛋白家族成员之一,含有两个串联溴结构域和额外的C末端。Bdf1溴结构域能特异识别并结合被乙酰化修饰的组蛋白H3和H4,募集TFIID复合物参与转录的起始过程。此外,它也是染色质重塑复合物SWR的亚基,参与染色质结构的调节。Bdf1上第187和354位酪氨酸是其溴结构域发挥功能所必需的关键位点,将这两点突变为苯丙氨酸后(bdf1-Y187FY354F),其溴结构域与被乙酰化修饰的组蛋白H4的结合能力会完全丧失。本实验室前期研究发现Bdf1参与了DNA损伤修复,但其具体的功能和分子机制尚不清楚。为了探究Bdf1在DSB损伤应答中的作用,我们将Bdf1溴结构域上两个关键位点突变,构建了Bdf1溴结构域功能缺失突变体(以下称为Y2F),对其溴结构域在DNA双链断裂修复中的功能进行了初步研究,取得以下结果:1)Bdf1溴结构域促进DNA损伤修复。我们检测了Y2F对DNA损伤药物的敏感性,发现Y2F对羟基脲(Hydroxyurea,HU)、喜树碱(Camptothecin,CPT)、甲基硫酸酯(Methylmercuric sulfate,MMS)及腐草霉素(Phleomycin)等DNA损伤药物的敏感性显著增强,说明Bdf1溴结构域在DNA损伤修复中发挥重要作用。进一步我们通过基于染色质的NHEJ修复实验和异位同源重组修复(ectopic homologous recombination)实验,探究Bdf1溴结构域对NHEJ和HR修复的影响。发现相较于野生型细胞1%的NHEJ修复效率,Y2F的NHEJ修复效率显著下降至0.3%。与此同时,野生型细胞同源重组修复效率约为85%,而Y2F细胞同源重组修复效率显著降低至48%左右。这些结果表明Bdf1溴结构域促进DNA双链断裂修复,有利于NHEJ和HR两种修复途径。2)Bdf1溴结构域促进染色质重塑复合物的募集。染色质重塑复合物可通过松弛染色质结构、调控DNA损伤检查点和促进长距离剪切等方面促进HR修复。为了探究Bdf1溴结构域与染色质重塑复合物之间的关系,我们检测了Y2F突变体的染色质重塑复合物在DNA双链断裂处的富集情况,发现相较于野生型细胞,Y2F内Fun30、Ino80、Rsc2等染色质重塑复合物亚基的募集量显著降低,表明Bdf1溴结构域有利于FUN30、INO80及RSC等染色质重塑复合物的招募。进一步我们通过微球菌酶消化(MNase Digestion)和ChIP的方法分别检测Y2F突变体的染色质结构,发现Bdf1溴结构域缺失并不明显影响全基因组范围内和DNA损伤位点附近的染色质结构。3)Bdf1溴结构域促进DNA末端剪切及DNA损伤检查点的激活。本实验室前期研究发现Bdf1溴结构域促进末端剪切。为进一步探究了Bdf1溴结构域在起末端剪切中的功能,我们通过ChIP技术,检测了Y2F突变体中起始剪切的Mre11和长距离剪切酶Dna2/Sgs1和Exo1近在断端1kb的募集情况,发现长距离剪切酶显著下降,而Mre11剪切酶的招募不受影响,说明Bdf1溴结构域有利于Dna2/Sgs1和Exo1长距离剪切酶的招募。因为末端剪切受损会影响Mec1依赖的DNA损伤检查点激活,所以我们检测了Y2F内检验点效应蛋白Rad53的磷酸化,发现Y2F突变体的Rad53磷酸化与野生型细胞相比显著延迟。同时我们计数了DNA双链断裂4h后,野生型和Y2F突变体阻滞在G2/M期的细胞比例,发现WT细胞中处于G2/M期的细胞比例为90%左右,而Y2F内G2/M期细胞比例为60%,显著低于野生型细胞。相应地,我们检测到Y2F细胞中检查点上游组蛋白H2A的磷酸化(γH2A)水平也有所下降。上述结果说明Bdf1溴结构域具有促进DNA损伤检查点激活的功能。4)Bdf1促进重要修复蛋白的募集。通过ChIP实验,我们检测了HR修复途径中RPA、Rad51蛋白及NHEJ修复途径的KU复合物在DNA损伤位点的募集情况。发现Y2F突变体内这些蛋白的募集显著降低,表明Bdf1溴结构域可以促进这些修复蛋白的招募。更重要的是,过表达Rad51后,Y2F突变体的HR修复效率由55%显著提升至78%左右,表明Rad51的募集缺陷是造成Y2F突变体HR修复效率下降的关键原因。