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研究背景糖尿病已成为日益严重的全球性健康负担。据统计2013年全球患糖尿病的总人数为3.82亿,预期到2035年,患糖尿病的人数可能达到5.92亿。糖尿病是世界范围内致残率和致死率的主要原因,是心血管疾病的独立危险因素。众所周知,糖尿病可改变血管的结构和功能,与糖尿病血管并发症如冠心病、视网膜病变、脑血管意外、糖尿病肾病有着紧密关系。糖尿病导致血管功能障碍的机制包括内皮依赖的和内皮非依赖的机制,内皮依赖的血管功能障碍的分子机制已经得到了充分的论证与研究,但是内皮非依赖的分子机制研究较少。大电导钙激活钾通道(Large conductance Ca2+-activated K+channel,BK)广泛表达于血管平滑肌细胞,是血管张力维持的重要决定因素,BK通道的活性受到其β1亚基（BK-β1）的调节。越来越多的证据显示,1型和2型糖尿病血管损伤的普遍特征是BK-β1表达的降低。肌肉环指蛋白1（Muscle RING finger protein 1,Mu RF1）是泛素蛋白酶途径（ubiquitin proteasome pathway,UPP）中肌肉特异的泛素连接酶（Ubiquitin-protein ligase,E3s）,参与多种心脏和骨骼肌疾病的发病,同样也表达于血管平滑肌细胞。有研究发现,Mu RF1的coiled-coil结构域与BK-β1的N端有物理性接触,Mu RF1可能参与了糖尿病血管BK-β1的蛋白水解,导致BK通道活性的下调和血管功能的损伤。同时,Mu RF1蛋白表达受到核因子κB（NFκB）的调控,其机制与心肌和骨骼肌萎缩密切相关。另外,糖尿病血管中可以产生过多活性氧簇（reactive oxygen species,ROS）,ROS通过多种途径可激活NFκB。但是由于细胞类型的不同,ROS/NFκB信号通路是否参与了糖尿病小鼠主动脉平滑肌Mu RF1介导的BK-β1降解我们不得而知。研究目的探讨糖尿病小鼠主动脉平滑肌ROS/NFκB信号通路对Mu RF1介导BK-β1降解的调控机制。研究方法1.腹腔注射链脲霉素制备1型糖尿病小鼠模型,动物实验分为2组:（1）对照组;（2）糖尿病组。细胞实验分为2组:（1）低糖组;（2）高糖组。酶消法急性分离小鼠胸主动脉平滑肌细胞,膜片钳检测平滑肌细胞全细胞BK通道的电流变化;免疫沉淀检测糖尿病小鼠胸主动脉和高糖培养的MOVAS细胞（小鼠主动脉平滑肌细胞系）BK-β1的泛素化水平;Western blot检测糖尿病小鼠胸主动脉和高糖培养的MOVAS细胞BK-β1和Mu RF1的蛋白表达水平;Western blot检测糖尿病小鼠胸主动脉NOX-1、NOX-4、Rel A/p65和NFκB1/p50的表达水平。2.观察Mu RF1的下调对高糖培养的MOVAS细胞中BK-β1表达的影响。实验分为4组:（1）低糖+control si RNA组;（2）低糖+Mu RF1 si RNA组;（3）高糖+control si RNA组;（4）高糖+Mu RF1 si RNA组。向低糖或者高糖培养的MOVAS细胞转染control si RNA或Mu RF1 si RNA。利用Western blot和细胞免疫荧光检测BK-β1和Mu RF1的蛋白表达水平。3.观察蛋白酶抑制剂MG132对BK-β1表达的影响。动物实验分为4组:（1）对照组;（2）对照+MG132组;（3）糖尿病组;（4）糖尿病+MG132组。对照+MG132组及糖尿病+MG132组的小鼠分别给予腹腔注射MG132 0.1 mg/（kg·d）治疗12周,对照组和糖尿病组的小鼠用同等体积DMSO腹腔注射治疗12周。细胞实验分为4组:（1）低糖组;（2）低糖+MG132组;（3）高糖组;（4）高糖+MG132组。低糖+MG132组和高糖+MG132组用10μmol/L的MG132处理24小时。Western blot检测BK-β1和Mu RF1的蛋白表达水平。4.观察ROS/NFκB信号通路对Mu RF1介导的BK-β1降解的调控作用。实验分为6组:对照组,对照+N-乙酰半胱氨酸（NAC,ROS清除剂）组,对照+吡咯烷二硫代氨基甲酸盐（PDTC,NF-κB抑制剂）组,糖尿病组,糖尿病+NAC组,糖尿病+PDTC组。对照+NAC组和糖尿病+NAC组给予NAC 100 mg/（kg·d）腹腔注射治疗,对照+PDTC组和糖尿病+PDTC组给予PDTC 50 mg/（kg·d）腹腔注射治疗,对照组和糖尿病组给予同等体积生理盐水腹腔注射。给予药物治疗12周后,Western blot和免疫组化检测胸主动脉BK-β1、Mu RF1、NFκB1/p50的表达水平;动脉血管环舒张反应性实验检测胸主动脉血管环对BK通道的特异性激动剂NS-1619的反应性;酶消化法急性分离小鼠胸主动脉平滑肌细胞,全细胞膜片钳实验记录小鼠胸主动脉平滑肌细胞BK通道的电流变化。实验结果1.电流-电压曲线显示糖尿病小鼠胸主动脉平滑肌细胞全细胞BK通道电流密度显著降低（P<0.05）;免疫沉淀结果显示糖尿病小鼠主动脉BK-β1的泛素化水平增加（P<0.05）,高糖培养的MOVAS细胞BK-β1的泛素化水平增加（P<0.05）;Western blot结果显示糖尿病小鼠主动脉和高糖培养的MOVAS细胞BK-β1蛋白表达水平降低（P<0.05）,Mu RF1的蛋白表达水平增加（P<0.05）,糖尿病小鼠主动脉NOX-1、NOX-4、Rel A/p65和NFκB1/p50的蛋白表达水平增加（P<0.05）。2.Western blot结果显示,与高糖+control si RNA组相比,转染Mu RF1 si RNA的高糖培养的MOVAS细胞Mu RF1蛋白表达水平显著下降（P<0.05）,BK-β1蛋白表达水平显著增加（P<0.05）。3.Western blot和电流-电压曲线结果显示,与糖尿病组相比,糖尿病+MG132组BK-β1蛋白表达水平显著增加（P<0.05）,BK通道电流密度显著增加;与高糖组相比,高糖+MG132组BK-β1蛋白表达水平显著增加（P<0.05）。4.与对照组、对照+NAC组和对照+PDTC组相比较,糖尿病组的BK-β1蛋白表达水平显著降低（P<0.05）,MuRF1和NFκB1/p50的蛋白表达水平显著增加（P<0.05）,动脉血管环对NS-1619的舒张反应性降低（P<0.05）,当刺激电压>50 m V时,糖尿病组主动脉平滑肌细胞全细胞BK通道电流密度显著降低（P<0.05）;与糖尿病组相比,糖尿病+NAC组及糖尿病+PDTC组BK-β1蛋白表达水平显著增加（P<0.05）,Mu RF1和NFκB1/p50蛋白表达水平显著降低（P<0.05）,动脉血管环对NS-1619的舒张反应性有显著改善（P<0.05）,当刺激电压>50 m V时,糖尿病+NAC组及糖尿病+PDTC组全细胞BK通道电流密度显著增加（P<0.05）。研究结论1.糖尿病小鼠胸主动脉平滑肌BK通道活性受损、BK-β1蛋白表达降低。2.糖尿病小鼠主动脉平滑肌Mu RF1对BK-β1亚基降解起到调控作用。3.NAC和PDTC可抑制糖尿病小鼠胸主动脉平滑肌Mu RF1介导的BK-β1降解,ROS/NFκB信号通路可能参与调控Mu RF1介导的BK-β1降解。