定心方是南方医科大学贾钰华教授的经验方,经过长期的临床和实验研究被证实不仅可以有效地防治快速型心律失常而且还可以减轻心肌缺血再灌注损伤。前期国家自然基金“心肌缺血及再灌注心律失常的蛋白组基础与定心方作用机制”的研究通过凝胶双向电泳和质谱鉴定发现抗增殖蛋白(prohibitins)是定心方的一个作用靶点,但其在心肌缺血再灌注损伤中的作用机制尚未明确。探寻其作用机制成为本研究的出发点。已有研究表明定心方减轻心肌缺血再灌注损伤的部分机制是调节MAPK通路中P38通路的表达,另外在肿瘤细胞增殖与凋亡的研究中发现prohibitin参与MAPK通路的调控,在炎症细胞中调控抗增殖蛋白表达相关的细胞因子,如TNF-α、NF-κB,IL-6等又与MAPK通路具有关联。由此,本研究设想在心肌缺血再灌注损伤中抗增殖蛋白参与定心方减轻心肌缺血再灌注损伤的机制,可能是通过MAPK通路实现的。本实验以此作为研究的切入点,进行体内外实验的研究。1.研究抗增殖蛋白在心肌缺血再灌注损伤中的表达及定心方的影响。2.研究定心方在心肌缺血再灌注中对MAPK通路的激活作用。3.探讨抗增殖蛋白参与定心方减轻心肌缺血再灌注损伤过程中与MAPK通路的关系。1.实验分组：40只SPF级雄性wistar大鼠,体重200-250g,随机分为假手术组,心肌缺血再灌注模型组,定心方高、中、低剂量组共5组,每组8只。2.实验处理：定心方高、中、低剂量组分别给予37.5g·kg-1·d-1、18.75 g·kg-1·d-1、9.375g·kg-1·d-1的药量,每日分为两次给药,连续灌胃7天；假手术组和模型组灌服生理盐水。末次给药前12h禁食不限水,在末次给药2h后除假手术组大鼠外均造模,结扎左冠状动脉前降支中上1/3处15min,再灌注30min。3.检测指标：术中记录大鼠再灌注时段Ⅱ导联心电图,进行心律失常评分。实验终点分离左室心肌,提取蛋白,应用western blotting法检测prohibitin、pP38、pJNK、pERK1/2蛋白表达,以GAPDH为内参蛋白,测量累积光密度。4.统计方法：心律失常评分属于等级资料,多组间比较采用完全随机设计多个样本的Kruskal-Wallis H检验法进行分析。实验数据用平均秩R表示。蛋白质表达累积光密度(IOD)的比值多组间比较应用Kruskal-Wallis H检验,组间多重比较应用Bonferroni法,数据用平均值±标准差(x±s)表示。抗增殖蛋白与MAPK通路中3个蛋白分别进行两两相关性分析,同时控制通路中其他两个蛋白对这种相关关系的影响作为控制变量,采用偏相关分析。1.大鼠心肌缺血再灌注心律失常评分多组间比较具有显著性差异(x2=29.816,P=0.000)。其中模型组心律失常评分平均秩最高(34.06),其次是定心方低、中、高剂量组(24.94、22.50、16.50),假手术组(4.50)最低。2.各组抗增殖蛋白表达具有显著性差异(x2=37.463、P=0.000)。与模型组(3.73±0.25)相比,定心方低、中、高剂量组表达顺次降低(3.06±0.12、2.08±0.09、1.65±0.13)(P＜0.05)且两两间比较差异显著(P<0.05),假手术组蛋白表达量最低(0.81±0.10)(P<0.05)。结果表明,缺血再灌注损伤可以引起抗增殖蛋白表达升高,定心方可以抑制其表达,作用随着药物剂量的增加而增强。3.各组间MAPK通路中的三个蛋白pERK1/2、pJNK、pP38的表达均有显著差异(pERK1/2:x2=32.212、P=0.000, pJNK: x2=34.469、P=0.000,pP38：x2=34.566、P=0.000)。与模型组(2.23±0.53)相比,定心方低、中、高剂量组pERK1/2表达顺次增加(4.39±0.46、5.03±0.67、5.65±0.71) (P＜0.05),而假手术组(1.93±0.25)无显著性差异(P＞0.05)；与模型组相比(pJNK:3.99±0.43,pP38：2.70±0.25),定心方低、中、高剂量组pJNK(3.33±0.32、2.86±0.34、2.33±0.41)、pP38(2.39±0.25、2.06±0.16、1.74±0.15)的表达顺次降低,假手术组最低(pJNK:1.47±0.15,pP38：2.70±0.25)。结果表明,此模型不能显著激活ERK通路,JNK、P38通路被激活,而在定心方的诱导下可以激活ERK通路,抑制JNK、P38通路的表达。4.抗增殖蛋白与pJNK、pP38具有显著相关性(r=0.738、P=0.000,r=0.683、P=0.000),抗增殖蛋白与pERK1/2无显著相关性(r=-0.265、P=0.107)。结果表明,在定心方的参与下prohibitin的表达与JNK、P38通路的激活具有正向相关性。1.定心方通过抑制抗增殖蛋白的应激性增高减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤。2.定心方通过激活抗凋亡通路ERK1/2,同时减少促凋亡通路P38、JNK通路的激活减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤。3.抗增殖蛋白可能是通过P38、JNK通路参与定心方减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤。48只雄性wistar大鼠,体重200-250g,随机分为4组,每组12只,分别灌服不同剂量定心方水煎剂,给药剂量分别为18.75 g·kg-1·d-1、37.5 g·g·kg-1·d-1、75 g·kg-1·d-1、150 g·kg-1·d-1,每日药量分两次灌胃,连续给药七天。末次给药前12h禁食不禁水,每组分别在末次灌药后30、60、90、120 min各取3只大鼠腹主动脉采血,分离血清,0.22μm微孔滤膜过滤除菌,56℃灭活30min,每只大鼠血清单独分装,-20℃保存备用。用Wistar乳鼠制备原代心肌细胞,接种于96孔培养板,每孔接种1×104个细胞。每只大鼠含药血清对应一个培养孔,即按药物浓度和采血时间分组,每组3孔,共16组。含药血清培养24h后,吸除原培养基,加入含H202浓度为200μm/L的无血清DMEM培养基继续培养3h。干预完成后,进行MTT试验,测量OD值。OD值属计量资料,经单样本K-S拟和优度检验(1-Sample K-S Test)符合正态分布,实验数据以平均值±标准差(x±s)表示。本实验是2因素4水平的设计,应用析因设计的方差分析法分析其交互效应及主效应,主效应间多重比较应用Bonferroni法；单独效应采用单因素方差分析(one-way ANOVA)。定心方剂量与给药时间因素存在交互效应(F=2.803,P=0.015)。定心方剂量因素的主效应差异具有统计学意义(F=56.030,P=0.000),OD值随药物剂量的增加而升高,但75 g·kg-1·d-1剂量组(0.956±0.276)和150 g·kg-1·d-1剂量组(1.020±0.269)间差异无统计学意义(P=0.075)；采血时间主效应的差异具有统计学意义(F=87.933,P=0.000),OD值随采血时间点的延长而升高,但90min组(0.991±0.228)和120min组(1.056±0.204)之间差异无统计学意义(P=0.073)；OD值最高点为75 g·kg-1·d-1*90min (1.124±0.139),75 g·kg-1·d-1*120min (1.209±0.132),150 g·kg-1·d-1*90min (1.234±0.132),150 g·kg-1·d-1*120min(1.020±0.269),且4点之间差异无统计学意义。定心方含药血清抗氧化应激损伤时大鼠的给药剂量是75 g·kg-1·d-1,采血时间点是90min药效最佳。10只wistar雄性大鼠,随机分为两组,每组5只。定心方组根据前节筛选的定心方含药血清制备方法,选择定心方剂量为75 g·kg-1·d-1,末次给药前12h禁食不禁水,末次给药90min后采血,分离血清,每只大鼠的血清单独分装。空白对照组灌服等体积生理盐水。每个样品取血清2ml,加入乙腈16ml,在涡旋器上震荡5min,3000r/mi n离心20min取上清液,40℃恒温,氮气吹干,加入甲醇1ml于涡旋混合器上溶解,0.22μm微孔滤膜过滤,即得样品溶液。筛选高效液相色谱质谱条件,考察方法的精密度、线性关系、稳定性、回收率,测定定心方含药血清盐酸小檗碱、盐酸黄连碱、盐酸巴马汀、丹参酮ⅡA、氧化苦参碱的含量。结果和结论：定心方含药血清中成分明确的物质及浓度是盐酸小檗碱1.4141±0.0224μg/ml,盐酸巴马汀0.3883±0.0082μg/ml,盐酸黄连碱0.4889±0.0156μg/ml,氧化苦参碱0.4663±0.0129μg/ml,丹参酮ⅡA未检出。筛选脂质体介导化学合成siRNA转染原代心肌细胞的理想浓度当心肌细胞融合至80%搏动良好时进行转染。转染前1-2小时,用0.1%胰蛋白酶消化细胞3-5分钟。重悬细胞,调整浓度至1×105/ml。细胞悬液接种至六孔板每孔2ml。应用siPORTTMNeoFXTM脂质体转染试剂,分别转染浓度为0,5,10,20,30nM Cy3-Negative siRNA分别进行转染24h后,应用荧光显微镜观察,及采用流式细胞仪进行转染效率及凋亡率检测,每项每组应用三个孔。根据筛选的最佳浓度将PHB siRNA ID s129542 (5’-3’GCUUUUAUUGUUACA CUUtt)和PHB siRNA ID s217968 (5’-3’ACUGUGAAAUUUAAUGAUUtt)稀释液等量混匀,进行转染,转染含有设置空白对照组,每组均设3个复孔。转染48h后,提取蛋白进行western blotting检测。siRNA转染效率和细胞凋亡率应完全随机设计多个样本比较应用Kruskal-Wallis H检验法进行分析,多重比较应用Bonferroni法。western blotting检测的光密度比值两组间比较应用两个独立样本的秩和检验采用Mann-Whitney Test检验法。实验数据以平均值±标准差(x±s)表示。1.在荧光显微镜下,CY3-Negative siRNA转染的细胞可激发出红色荧光,在同倍视野中,随siRNA浓度的增加,发光出荧光的细胞数也增多,而对照组则未见荧光。2.平均转染效率顺浓度增高各组分别是0.00±0.00%、7.55±0.70%、36.52±4.55%、60.14±3.94%、76.67±4.29%,组间差异具有统计学意义(n=3,x2=13.597,P=0.009),多重比较两两差异也均具有统计学意义(P<0.05)其中30nM组转染效率最高。流式细胞仪检测结果也表明siRNA浓度在0-30nM范围内转染效率与浓度成正向关系。3.经流式细胞仪检测,细胞平均凋亡率随转染浓度正向增高分别为3.00±0.87%、3.70±0.53%、3.94±0.52%、4.29±0.62%、4.55±0.43%,但各组间差异无统计学意义(n=3,x2=7.445,P=0.114),表明转染无明显细胞毒性。4.心肌细胞转染PHB siRNA后,PHB对应蛋白prohibitin表达比值(0.22±0.07)比对照组(0.85±0.06),平均下降74.11%,两组间差异具有统计学意义(U=0.000，P=0.0495)。siRNA可以通过脂质体转染试剂siPORTTM NeoFXTM介导进入原代大鼠心肌细胞内,其适宜浓度为30nM。1.研究抗增殖蛋白在心肌细胞氧化应激损伤中的表达及定心方的影响。2.研究定心方在心肌细胞氧化应激损伤中对MAPK通路的激活作用。3.探讨抗增殖蛋白参与定心方减轻心肌细胞氧化应激损过程中与MAPK通路的关系。实验共分为7个组：1.正常组(Normal),2.模型组(H202),3.定心方组(H202+DXF),4.PHBsiRNA干扰组(H2O2+PHBsiRNA),5.ERK阻断剂组(H202+U0126),6.JNK阻断剂组(H202+SP600125),7.P38阻断剂组(H202+SB203580)。每组设6个复孔,分别用于细胞凋亡检测与提取蛋白,每项各用3孔。siRNA转染24h后,更换培养基,定心方含药血清干预各组DMEM培养基含12.5%含药大鼠血清,其余各组培养基含12.5%空白对照大鼠血清。阻断ERK、JNK、P38通路各组在46h分别加入相应的阻断剂U012610、SP600125、SB203580使其在培养基中的浓度对应为10μM、25μM、5μM。转染48h后,用无血清的DMEM培养清洗培养板,最终加入和H2O2浓度为200 u M的培养基继续培养3h。实验终点分别进行细胞凋亡检测及蛋白免疫印迹检测。细胞凋亡率和蛋白质免疫印迹测量值累积光密度(IOD)与内参的比值,实验数据以平均值±标准差(x±s)表示；多组间比较应用完全随机设计多个样本比较的Kruskal-WallisH检验法进行分析,组间多重比较应用Bonferroni法。抗增殖蛋白与MAPK通路中3个蛋白分别进行两两相关性分析,同时控制通路中其他两个蛋白对这种相关关系的影响作为控制变量,采用偏相关分析。1.各组细胞的凋亡率存在显著差异(χ2=18.907,P=0.004)。与H2O2组(35.04%±2.27%)相比,H2O2+PHBsiRNA组(35.04%±2.27%)、H2O2+U0126组(42.65%±4.21%)细胞凋亡率无显著差异(P=1.000,P=0.053),H2O2+SP600125 (21.22%±1.84%)、H2O2+SB203580 (16.67%±2.49%)、H2O2+DXF (16.67%±2.4 9%)三组之间无显著差异(P＞0.05),凋亡率均低于H2O2组而高于normal组(35.04%±2.27%)(P＜0.05)。结果表明,过氧化氢刺激心肌细胞可以引起细胞凋亡率的增加,ERK阻断剂(U0126)干预无显著影响,而定心方、JNK阻断剂(SP600125)和P38阻断剂(SB203580)可以抑制凋亡率的增加,三者间抑制效果无显著差别。2.各组间prohibitin表达存在显著差异(χ2=18.719,P=0.005)。与H2O2组相比,H2O2+U0126组蛋白表达无显著差异(P＞0.05),H2O2+DXF组、H2O2+SB60 0125组和H2O2+SP600125组组蛋白表达显著增高(P＜0.05)且三组见相比无显著差异(P＞0.05),normal组和H2O2+PHBsiRNA组表达降低,且两组见相比无显著差异(P＞0.05),具体见结果表3-3、图3-2。结果表明,过氧化氢刺激刺激心肌细胞引起抗增殖蛋白表达升高,PHBsiRNA干扰可以有效抑制其表达增加、定心方P38阻断剂(SB203580)和JNK阻断剂(SP600125)可以促进其表达,U0126对其无显著影响。3.各组间pERK表达存在显著差异(χ2=18.009,P=0.006)。与H2O2组(2.55±0.13)相比,H2O2+SB600125组(2.62±0.11)和H2O2+SP600125 (2.62±0. 11)组蛋白表达无显著变化(P＜0.05),H2O2+DXF组(3.01±0.18)蛋白表达升高，H2O2+U0126组(1.54±0.05)和H2O2+PHBsiRNA组(2.15±0.11)表达降低但高于normal组(1.56±0.13)。结果表明,过氧化氢刺激作用于心肌细胞致激活ERK通路,致使pERK表达显著增强,ERK阻断剂(U0126)可以抑制其活化,而定心方可以促进其活化,JNK阻断剂(SP600125)和P38阻断剂(SB203580)无显著影响。4.各组间pJNK表达存在显著差异(x2=16.398，P=0.012)。与H202组(3.01±0.21)相比,H2O2+SP600125组(2.00±0.23)和H2O2+DXF组(1.76±0.23)蛋白表达显著下降(P＜0.05)但高于normal组(1.53±0.23),H2O2+PHBsi RNA组(3.01±0.16)、H2O2+U0126组(2.82±0.07)、H2O2+SB203580组(2.84±0.27)与H2O2组无显著差异(P＞0.05)。结果表明,过氧化氢刺激干预心肌细胞激活JNK通路,导致pJNK表达显著升高,JNK阻断剂(SP600125)和定心方可以显著抑制这种趋势,P38阻断剂(SB203580)和ERK阻断剂无显著影响。5.各组间pP38表达存在显著差异(x2=16.277，P=0.012)。与H202组(2.45±0.23)相比,H2O2+ SB203580组(1.25±0.14)和H2O2+DXF组(1.78±0.19)蛋白表达显著降低(P＜0.05),但高于normal组(1.17±0.10),H2O2+PHBs iRNA组(2.42±0.27)、H2O2+U0126组(2.33±0.34)、H2O2+SP600125组(2.29±0.14)与H202组无显著差异(P＞0.05)。结果表明,过氧化氢刺激作用于心肌细胞激活P38通路,诱导pP38表达显著升高,P38阻断剂和定心方可以显著减少其影响,JNK阻断剂(SP600125)和ERK阻断剂(U0126)无显著影响。6.抗增殖蛋白与MAPK通路中3个蛋白分别进行两两相关性分析,同时控制通路中其他两个蛋白对这种相关关系的影响作为控制变量,采用偏相关分析,结果显示,prohibitin与pERK1/2具有显著相关性(r=0.643、P=0.003),但pr ohibitin与pJNK、pP38无显著相关性(r=-0.052、P=0.832,r=-0.031、P=0.900)。1.定心方通过促进抗增殖蛋白的表达减轻大鼠心肌细胞氧化应激损伤。2.定心方通过促进抗凋亡通路ERK的激活,同时减少促凋亡通路P38、JNK通路的激活减轻大鼠心肌细胞氧化应激损伤。3.抗增殖蛋白可能是通过ERK通路参与定心方减轻大鼠心肌细胞氧化应激损伤。1.定心方通过调节MAPK通路减轻心肌缺血再灌注损伤。2.定心方可以抑制抗增殖蛋白在大鼠缺血再灌注损伤时的表达,而促进氧化应激心肌细胞中抗增殖蛋白的表达。3.抗增殖蛋白参与定心方减轻心肌缺血再灌注损伤,可能通过介导细胞双向信号传递或者受到双向信号传递通路的调节。4.定心方含药血清抗氧化应激损伤时大鼠的给药剂量是75 g. kg-1·d-1,采血时间点是90min药效最佳。5.定心方含药血清中成分明确的物质及浓度是盐酸小檗碱1.4141±0.0224μg/ml,盐酸巴马汀0.3883±0.0082μg/ml,盐酸黄连碱O.4889±0.0156μg/ml,氧化苦参碱0.4663±0.0129μg/ml,丹参酮ⅡA未检出。6.siRNA可以通过脂质体转染试剂siPORTTM NeoFXTM介导进入原代大鼠心肌细胞内,其适宜浓度为30nM。