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目的:肌动蛋白(Actin)是一类形成微丝的高度保守的多功能蛋白,其中F-actin才具有生理活性。Actin参与许多重要的细胞过程,除外细胞连接和细胞形状的建立和维持、迁移、吞噬、细胞信号传导等,它对细胞的凋亡、增殖也有着重要的影响。热休克蛋白(Heat shock protein,HSPs)是一种急性期反应蛋白,作为分子伴侣是当下研究的热点,其中DnaJ/HSP40,作为HSP70的辅助分子伴侣保护损害的细胞。此外,HSP40作为分子伴侣可以影响多种病毒的复制,同时还可作为免疫佐剂调节机体的免疫应答。临床上我们用温热(44℃,30min)治疗寻常疣、跖疣等,团队前期实验中证实温热影响HaCaT细胞的抗病毒免疫,DnaJA4敲除联合温热增强这一反映,同时质谱分析显示DnaJA4与细胞骨架蛋白——微管蛋白、肌动蛋白发生相互作用。因此本研究的目的是研究DnaJA4在温热过程对HaCaT细胞F-actin的影响,从细胞骨架角度探索DnaJA4在温热反应中发挥的作用。研究方法:1、研究对象:培养野生型(Wild-type,WT)和DnaJA4基因敲除(Knock out,KO)HaCaT细胞,37℃为未温热组,44℃温热干预30min为温热组(包括温热后6h、温热后12h、温热后24h),两种类型的细胞分别于37℃以及温热后6h、12h、24h四个时点进行检测。2、免疫荧光(Immunofluorescence,IF):利用特异性染料鬼笔环肽对F-actin进行染色,比较温热前后WT细胞和DnaJA4 KO细胞的细胞骨架形态差异。3、流式细胞术(Flow cytometry,FCM):利用F-actin流式抗体染色后,检测F-actin的平均荧光强度,比较F-actin在WT细胞和DnaJA4 KO细胞中的表达差异。4、免疫印迹(Western Blot,WB):检测F-actin及相关通路蛋白RhoA、ROCK1、E-cadherin、β-catenin的表达,比较上述蛋白温热前后在WT细胞和DnaJA4 KO细胞中的表达差异。结果:1、免疫荧光染色:在未温热组,与WT细胞相比,DnaJA4 KO细胞周围伪足减少,细胞间连接增多。在温热组,与未温热细胞相比,温热干预后WT细胞和DnaJA4 KO细胞的细胞间连接均减少,但WT细胞膜周围伪足增多。2、流式细胞实验:与WT细胞相比,DnaJA4 KO细胞F-actin平均荧光强度高,差异具有显著性(P<0.01)。DnaJA4 KO细胞F-actin表达较WT细胞增高。3、免疫印迹实验:(1)与未温热组相比,温热后WT细胞和DnaJA4 KO细胞F-actin都呈现先降低后增高的表达趋势,具体表现为:温热后6h细胞F-actin表达减少,温热后12h表达逐渐回升至未温热水平,但WT细胞温热后24h维持在稍低于未温热水平,而DnaJA4 KO细胞温热后24h明显超过了温热前水平。此外,温热后DnaJA4 KO细胞F-actin表达均明显高于WT型。DnaJA4的敲除增加了温热过程中HaCaT细胞F-actin的表达。(2)与此同时,F-actin的上游因子ROCK1、RhoA,在温热后6h、12h、24h也呈现先少后多的表达趋势,而且在DnaJA4 KO细胞中的表达均明显高于野生型,与F-actin一致。(3)另一方面,WT细胞和DnaJA4 KO细胞在温热后E-cadherin表达趋势均呈降低,但温热后DnaJA4 KO细胞E-cadherin表达均明显高于WT细胞。结论:温热影响HaCaT细胞F-actin的表达。DnaJA4的敲除增加了HaCaT细胞温热过程中F-actin的表达。DnaJA4通过调控F-actin及相关通路蛋白的表达参与温热影响HaCaT细胞。