目的:吗啡依赖是一种严重的强迫性精神障碍,不仅对依赖者本人的健康造成严重危害,还是严重的社会公共安全问题。目前的研究表明吗啡依赖可引发全身各个系统的病理生理学改变,其中对中枢神经系统的损害尤为重要,以往研究表明几乎所有药物滥用都可导致多巴胺神经递质的释放变化。吗啡依赖导致的多巴胺神经递质的改变可能与成瘾行为密切相关。黑质(substantia nigra,SN)和纹状体(striatum)是中枢神经系统两个重要的多巴胺调控区域,SN是典型多巴胺神经细胞核团,它的投射区域为纹状体,在吗啡依赖中SN多巴胺神经细胞的改变必然会对纹状体的神经细胞产生影响。本课题组前期研究发现慢性吗啡依赖可导致SN多巴胺神经细胞的损伤,但尚未对投射区及参与损伤的相关蛋白进行观察研究。神经胶质细胞源性神经营养因子(Glial derived Neurotrophic Factor,GDNF)、同源盒蛋白转录因子1(Engrailed1,EN1)、α-突触核蛋白(α-Synuclein,α-Syn),均是多巴胺重要的调节因子,它们在慢性吗啡依赖中表达的动态变化及相互关系未见文献报道,同时以往研究表明在吗啡依赖中有多种应激因素的影响,而内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)是否参与了吗啡依赖导致的多巴胺神经损伤有待深入探讨。本研究侧重从病理形态学角度系统观察了SN和纹状体神经细胞的病理性改变,探讨了多巴胺相关转录因子及ERS相关蛋白的表达变化并且采用全景组织细胞定量分析系统进行了定量分析,旨在为吗啡依赖导致的多巴胺神经损伤的机制研究提供病理形态学依据。方法:1本实验采用健康SD(Sprague-Dawley)雄性大鼠,体重为(250±20)g,90只。根据随机分组原则,分为对照1周组、吗啡依赖1周组、对照3周组、吗啡依赖3周组、对照6周组、吗啡依赖6周组。每组15只。对于吗啡依赖各组大鼠,采用背部皮下递增注射盐酸吗啡的方法,建立吗啡依赖模型,每天二次(8:00,20:00),连续注射5天。剂量分别为10mg·kg-1、20mg·kg-1、30mg·kg-1、40mg·kg-1、50mg·kg-1。每天注射药物前进行体重测量。每次注射前均用75%酒精严格消毒,一次性注射器注射。5天后确认吗啡依赖形成后,吗啡依赖1周组、3周组、6周组分别给予30mg·kg-1盐酸吗啡背部皮下注射,每天二次(8:00,20:00),分别连续注射至1周、3周、6周,建立三个不同时段的吗啡依赖大鼠模型。对照组分别注射等剂量的生理盐水,分别连续注射至1周、3周、6周。模型建立后,各实验组及相应对照组大鼠于实验结束第二天处死,大鼠脑组织经固定、脱水、透明、包埋、连续切片等处理后,待做各种组织病理学染色使用。1)记录大鼠戒断症状2)记录大鼠体重变化3)旷场实验观察大鼠自发活动情况4)甲苯胺蓝、焦油紫特殊染色观察黑质神经细胞尼氏体变化5)HE染色观察纹状体病理形态学改变6)免疫组织化学染色免疫荧光多重标记观察相关蛋白表达变化2细胞计数:运用全景组织细胞定量分析系统(MMTC)对纹状体区神经细胞及神经纤维(棕色)进行统计,目前此软件已经在国内、外得到广泛认可。SN区细胞计数,在100倍视野下对阳性细胞进行计数。两个独立的观察者进行计数取其平均值为最终阳性细胞计数。3结果处理与统计分析:采用SPSS21.0统计软件进行分析。各组均数的比较行单因素方差分析(One-way ANOVA),用最小显著差法(Least Significant Difference,LSD)作两两比较,所有统计结果以P<0.05为有显著统计学差异。结果1.大鼠戒断症状结果通过给予大鼠皮下注射盐酸纳洛酮诱导戒断症状,结果显示与对照组相比,吗啡组出现明显戒断症状(P<0.05)。依据戒断症状评分标准,吗啡组与对照组相比具有显著性差异(P<0.01)。表明吗啡依赖大鼠模型建立。2.大鼠体重变化结果随着时间的延长对照组大鼠体重呈逐渐增加趋势。吗啡依赖组体重也呈增加趋势,但与对照组体重相比,实验组大鼠体重增长速度明显降低,且具有显著性差异(P<0.05)。3.旷场实验结果与对照组相比,随着吗啡依赖时间延长,大鼠粪便粒数在吗啡依赖1周、3周、6周明显增加;与对照组相比,随着吗啡依赖时间延长,吗啡依赖大鼠运动总距离减少;与对照组相比,随着吗啡依赖时间延长,吗啡依赖大鼠中央区运动距离及时间显著减少,并且在吗啡依赖3周和6周大鼠在中央区的运动轨迹变得平直。4.黑质神经细胞尼氏体变化对照组大鼠黑质区可见神经细胞胞浆丰富,胞浆内尼氏体清楚可见。与对照组相比,吗啡依赖1周组可见胞浆内尼氏体染色变浅,部分神经细胞水肿;吗啡依赖3周组可见部分胞浆内尼氏体消失,神经细胞固缩改变;吗啡依赖6周组可见尼氏体消失神经细胞数目增多,固缩、深染神经细胞数目增多。5.纹状体神经细胞变化随着吗啡依赖时间延长,神经细胞出现水肿、噬神经现象、细胞核固缩神经细胞结构不清、核膜消失等现象。6.黑质免疫组织化学染色6.1 GDNF+-TH+在黑质多巴胺能神经细胞的共表达变化GDNF+-TH+阳性共表达在各对照组中无明显差异。吗啡依赖1周组、3周组、6周组与对照组相比GDNF+-TH+阳性共表达细胞百分比明显减少。6.2 EN1+-TH+在黑质多巴胺能神经细胞的共表达变化EN1+-TH+阳性共表达在各对照组中无明显差异。吗啡依赖1周组与对照组相比,EN1+-TH+阳性共表达无明显差异。吗啡依赖3周组、6周组与对照组相比EN1+-TH+阳性共表达细胞百分比明显减少。6.3 p-PERK+-TH+在黑质多巴胺能神经细胞的共表达变化p-PERK+-TH+阳性共表达在各对照组中无明显差异。吗啡依赖1周组与对照组相比,p-PERK+-TH+阳性共表达无明显差异。吗啡依赖3周组、6周组与对照组相比p-PERK+-TH+阳性共表达细胞百分比明显增多。6.4 p-IRE1与TH在黑质多巴胺能神经细胞的表达变化TH阳性表达在各对照组中无明显差异。吗啡依赖1周组与对照组相比,TH阳性表达细胞数无明显差异。吗啡依赖3周组、6周组与对照组相比TH阳性表达细胞数明显减少。p-IRE1阳性表达在各对照组中无明显差异。吗啡依赖1周组、3周组、6周组与对照组相比p-IRE1阳性表达细胞数明显增多。7.纹状体免疫组织化学染色7.1 GDNF在纹状体神经细胞中的表达变化GDNF阳性表达在各对照组中无明显差异。吗啡依赖1周组与对照组相比,GDNF阳性表达无明显差异。吗啡依赖3周组、6周组与对照组相比GDNF阳性表达明显减少。7.2 EN1在纹状体神经细胞中的表达变化EN1阳性表达在各对照组中无明显差异。吗啡依赖1周组与对照组相比,EN1阳性表达无明显差异。吗啡依赖3周组、6周组与对照组相比EN1阳性表达明显减少。7.3α-突触核蛋白在纹状体的表达变化α-突触核蛋白阳性表达在各对照组中无明显差异。吗啡依赖1周组与对照组相比,α-突触核蛋白阳性表达无明显差异。吗啡依赖3周组、6周组与对照组相比α-突触核蛋白阳性表达明显增多。结论:本实验成功建立了不同时程慢性吗啡依赖模型,通过旷场实验、甲苯胺蓝染色、焦油紫染色、HE染色、免疫组织化学染色、免疫荧光多重标记等方法进行了研究。研究结果显示:慢性吗啡依赖可导致大鼠行为运动改变及SN和纹状体区神经细胞的损伤,多巴胺神经调节因子GDNF、EN1、α-Syn及内质网调节因子PERK、IRE1的表达呈现了明显的动态变化,提示上述调节因子参与了吗啡依赖导致的SN、纹状体的神经损伤。