2006年,Yamanaka等系统研究小鼠和人胚胎干细胞(Embryonic Stem Cells,ES)多能性相关因子时发现4个转录因子:Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc(OSKM)可以成功将成纤维细胞重编程为ES样细胞,称之为诱导多能干细胞(induced Pluripotent Stem cells, iPS细胞),该细胞在形态、多能性维持和分化潜能上与胚胎干细胞一致,且避免了伦理学争议和异体细胞移植排斥等问题[1, 2]。因此,iPS细胞已代替ES细胞在疾病模型、毒理学研究、药物敏感性筛选、替代治疗等方面发挥重要作用。本文目的之一是借鉴国内外通行的技术,在本学科的干细胞中心建立人真皮成纤维细胞的iPS细胞,并对方法进行优化。其次,对于iPS冷冻保存,同ES一样,目前还没有非常有效或者标准化的冷冻保存技术。当前广泛采用的“慢冻-快融法”冷冻保存技术,在应用于iPS细胞时存在着复苏效率低下、解冻后大量克隆团块死亡或自发分化的问题。因此,本文第二部分的工作是研究一种简单、经济、实用、有效的冷冻保存及复苏方法,以满足iPS的冷冻保存和研究的需要。目的:1)建立两种类型的人成体细胞系:真皮成纤维细胞和毛囊细胞细胞系,借助逆转录病毒载体法将Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc四种基因导入成纤维细胞,进而将其重编程为iPS细胞。建立该技术平台,为本学科开展iPS细胞相关研究及应用奠定了基础。2)建立和研究麦管玻璃化法冷冻保存人诱导多能干细胞的方法,并进行可行性评估。方法:一、逆转录病毒介导的人诱导多能干细胞建系方法的相关研究1.获得两种人成体细胞签署知情同意后,采用标准消化法从外科手术时切除的患者皮肤中获得人皮肤成纤维细胞和拔取的含完整根鞘的毛囊在神经干细胞培养液贴壁生长获得毛囊细胞。2.逆转录病毒质粒鉴定?逆转录病毒质粒pMX-hOCT4,pMX-hSOX2,pMX-hKLF4,pMX-hc-Myc, pMX-GFP系统经过转化扩增酶切鉴定,OCT4经Xho I、pMX-hSOX2,pMX-hKLF4,及pMX-hc-Myc经Not I进行酶切,产物用2%的琼脂糖凝胶电泳。?3. pMX逆转录病毒系统生产及感染能力鉴定按脂质体介导的瞬时转染标准方法,用PLAT A细胞包装pMX-GFP病毒,48h后观察绿色荧光;用病毒上清感染成纤维细胞,24~48h后荧光显微镜下观察绿色荧光,并以流式细胞仪检测感染效率。4.逆转录病毒载体法重编程成体细胞为iPS细胞用1:1:1:1的OSKM混合逆转录病毒感染提前24h准备的细胞总数为1x105的人成纤维细胞,同时采用pMX-GFP病毒感染相同数目的体细胞作用感染效果指示,并选用10ng/ml聚凝胺增加感染效率;24小时后重复一次,可重复3次。最后一次重复24小时后转移感染后细胞到饲养层细胞上,24小时后换成ES培养液,之后每天更换培养液,观察细胞形态变化并记录第一个克隆出现时间,直到第二十天克隆足够大时挑克隆扩大培养。5.人iPS的特性鉴定原代克隆行AKP染色和TRA-1-81活细胞染色鉴定;iPS细胞系传代培养至第10代后,进行核型分析;通过RT-PCR法和间接免疫荧光法检测人ES细胞标志性基因表达;检测OCT4启动子在诱导前后的甲基化表达变化;悬浮培养观察拟胚体形成及分化情况;iPS细胞接种至SCID小鼠皮下,观察畸胎瘤形成情况。二、麦管玻璃化法冷冻人iPS细胞将机械法切割的HDF-iPS细胞团块,依次在10%玻璃化冷冻液和20%玻璃化冷冻液中处理后保存于20%的冷冻液中,封装于0.25mL麦管并快速置于液氮中保存。解冻时将iPS团块依次置入0.2M蔗糖溶液和0.1M蔗糖溶液后,接种至饲养层上培养。检测复苏效率,并对解冻后长期培养的iPS细胞进行特性鉴定,包括:碱性磷酸酶染色、OCT4等多能因子免疫荧光染色、RT-PCR法检测内源性干细胞因子Oct4和Sox2的表达、拟胚体分化、神经细胞分化和畸胎瘤分化能力检测等。结果:一、人诱导多能干细胞系的建立1.获得两种人成体细胞:采用标准消化法从外科手术时切除皮肤中获得人皮肤成纤维细胞,成长梭状,生长迅速,可稳定传代及冷冻保存;直接拔取的含完整根鞘的毛囊在神经干细胞培养液中贴壁生长获得呈椭圆形,聚集生长的毛囊细胞。2.逆转录病毒质粒成功转化后酶切,产物经2%琼脂糖凝胶电泳均可见预期大小的条带。3.pMX逆转录病毒包装及鉴定:由于PMX-OSKM无GFP指示,以携带EGFP基因的pMX-GFP作为阳性参照,将pMX-GFP以脂质体2000瞬时稳定转染PLAT A细胞,48h后倒置荧光显微镜下可见绿色荧光,预示转染成功。4.利用细胞模型在体外验证pMX逆转录病毒系统能否正常表达:用携带EGFP基因的逆转录病毒感染成纤维细胞,48h后在倒置荧光显微镜下观察到绿色荧光,这表明转基因EGFP在成纤维细胞内能够正常表达。流式细胞仪可检测到pMX-GFP感染成纤维细胞效率为81.4%。5.逆转录病毒载体法重编程成纤维细胞为iPS细胞:病毒感染后第4天开始可见到明显细胞形状改变,长梭状明显缩短并逐渐聚集生长,第14天可见ESC样克隆出现,第20天克隆足够大可以挑克隆以扩大培养。6.iPS细胞生物学特性鉴定:(1)第20天时碱性磷酸酶染色和活细胞多能因子TRA-1-81染色阳性;(2)具有典型的ES细胞克隆形态,具有正常二倍体核型,诱导后OCT4启动子表现为高度去甲基化;(3)表达ES细胞特有的标志性基因;(4)具有体外分化形成囊性拟胚体的能力,和在SCID鼠体内形成畸胎瘤的能力。二、玻璃化冷冻及玻璃化解冻HDF-iPS解冻后,可见部分细胞团块24小时内贴壁生长,部分则完全松散解离不能贴壁而死亡,麦管玻璃化法冷冻保存的iPS细胞解冻后复苏率可达77.4±13.12 %,慢冻-快融复苏率为25.8±10.64%(n=4);方差分析, p<0.01,两者有显著性差异。解冻后iPS长期传代培养仍能维持其特性:碱性磷酸酶阳性,OCT4、SOX2、NANOG、SSEA4、TRA-1-60免疫染色阳性,RT-PCR可检测到内源性oct4和sox2的表达,核型检测未见异常改变。具备EB、神经细胞和畸胎瘤分化能力。体外在去除bFGF和饲养层后细胞后自发分化成EB, EB分化5天后转至神经前体细胞培养基,经两代以上的传代和培养均获得了均一的神经前体细胞,细胞短小呈梭形,在PO/FN上呈克隆式生长,表达NESTIN,在撤除bFGF后,神经前体细胞发生分化,在分化第11天时出现TuJ1阳性的神经元,继续分化4周后可见到分化的GFAP阳性的神经胶质细胞。结论:1.从人皮肤细胞及毛发中分别获取成纤维细胞和毛囊细胞,并能运用Oct4、Klf4、c-Myc和Sox2四种基因成功将成纤维细胞重编程为iPS细胞。2.所得iPS细胞系具有人ES细胞的一些生物学特性,且在体外长期传代中能够维持此特性,初步证明建立了人iPS细胞系。3.麦管玻璃化冷冻技术可以有效保存iPS细胞,解冻后的iPS细胞在后续传代培养中仍然保持其特性。4.本课题引进和优化了人iPS细胞的相关技术,为本学科开展iPS细胞研究及应用奠定了基础。