梭鱼是我国沿海地区低盐度滩塘和海水池塘养殖的重要经济鱼类,也是江苏沿海正在开发的海、淡水养殖新兴品种之一。目前梭鱼的营养需要研究还很有限,配合饲料的配制主要借鉴其他杂食性鱼类的营养需要,在养殖中常发现梭鱼体(尤其是腹部)脂肪过量蓄积的现象。作为配合饲料的重要营养成分:脂肪、蛋白质和糖类的不平衡均会导致脂代谢紊乱和脂肪的过量蓄积,其发生、发展过程和脂代谢关键因子有着重要的联系。本文借助分子生物学和生物信息学手段,首次克隆获得梭鱼脂代谢关键因子过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferator-activated receptor,PPAR)α 和γ、脂蛋白脂酶(lipoprotein lipase,LPL)基因全长cDNA和脂肪酸合成酶(fatty acid synthase)基因cDNA片段,测定了梭鱼上述基因在不同组织中的表达模式;研究了饲料脂肪、蛋白水平对梭鱼体组织脂肪蓄积和脂代谢基因表达的影响。研究结果可以为梭鱼配合饲料的开发及梭鱼脂质代谢的调控提供必要的参考。1.饲料脂肪水平对梭鱼生长、血液生化和肝脏抗氧化性能的影响采用单因子浓度梯度法,以鱼油为脂肪源,制成脂肪含量分别为2.04%、4.83%、7.47%、9.79%、12.01%、14.59%的六组等氮等能(蛋白含量为 30.70 土0.12%;总能22.32±0.13 MJ/kg)的饲料。健康的梭鱼鱼种(均重9.5±0.3 g),随机分为6组,每组3个重复,每个水族箱30尾鱼,分别投喂以上6种不同脂肪水平的饲料,饲养60d。试验结束后,饥饿24h,采样,测定。结果显示:7.47%和9.79%脂肪水平组增重率、饵料系数均差异不显著(P>0.05),增重率显著高于其他各组(P<0.05),饵料系数显著低于其他各组(P<0.05);9.79%脂肪水平组蛋白质效率显著高于其它各组(P<0.05),和7.47%组差异不显著(P>0.05);采用二次多项式回归模型分析梭鱼增重率与饲料脂肪水平之间的关系(二次性,P<0.001),确定了梭鱼适宜的脂肪水平,脂肪水平作为自变量(X),增重率作为因变量(Y),得到回归方程:Y=-0.8238 X2+14.949 X+162.51(R2=0.7750),当X=9.1%时,梭鱼幼鱼的增重率最高。血浆谷丙转氨酶、谷草转氨酶水平随脂肪水平的增加显著升高(线性,P<0.05);脂肪水平对甘油三酯、胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇四种血脂指标影响不显著(P>0.05)。过氧化氢酶活性随脂肪水平的升高呈先升高后降低的趋势(二次性,P<0.001),总超氧化物歧化酶活性表现出相同的变化趋势(二次性,P<0.001),总抗氧化能力随脂肪水平的升高而下降(线性,P=0.014),与此相反,丙二醛含量随脂肪水平的升高而升高(线性,P<0.001)。鉴于脂肪水平为7.47%和9.79%时,鱼体均获得了较好的生产性能和肝脏生化指标,因此梭鱼幼鱼饲料中脂肪水平以7.5%～10%为宜。2.饲料脂肪水平对梭鱼形体指标、体脂蓄积和脂肪酸组成的影响饲养方案同1。结果表明:肝体指数和脏体指数均随脂肪水平的升高呈先降低后升高的趋势(二次性,P<0.05),脂肪水平为4.83%、7.47%、9.79%、12.01%的四组间,差异均不显著(P>0.05)。肌肉和全鱼中脂肪含量和饲料脂肪水平呈正相关(线性,P<0.05),肌肉、肝脏和肠系膜脂肪三种组织脂肪蓄积量占鱼体总脂的比例分别为 20.30%～24.31%、2.43%～2.95%、11.33%～12.47%;各脂肪水平组间差异均不显著(P>0.05)。随着饲料脂肪水平(鱼油)的增加,三种组织和全鱼油脂中多不饱和脂肪酸的含量均有所增加,n-3/n-6多不饱和脂肪酸的比例也显著提高(P<0.05)。研究还发现,各试验组内,三种组织和全鱼油脂中22:6n-3含量都高于20:5n-3。3.梭鱼脂肪代谢相关基因的克隆及组织表达分析采用反转录聚合酶链式反应和cDNA末端快速扩增法技术克隆了梭鱼PPARα、PPARγ、LPL基因全长cDNA序列和FAS基因部分cDNA序列;并采用实时荧光定量PCR技术研究了梭鱼上述4种基因在不同组织中的表达情况,结果如下:(1)PPARα基因全长cDNA序列克隆及组织表达分析克隆了梭鱼PPARα基因全长cDNA序列(GenBank:KJ848472.1),包含2409个碱基,编码478个氨基酸。序列比对分析表明,PPARa基因具有4个功能区域,分别为保守性差的N端区域、DNA结合区、可变的铰链区、C端配体结合区;梭鱼PPARα和其他物种的相似性很高,一些重要的功能位点在进化过程中高度保守。PPARα基因在所有被检测组织中均有表达,其中,在肝脏组织表达量最高,其次是脑、胃、皮肤、脾、腹腔肠系膜脂肪、鳃、肾、肠、心脏,肌肉中表达量最低。(2)PPARy基因全长cDNA克隆及组织表达分析克隆了梭鱼PPARγ基因全长cDNA序列(GenBank:KJ848473.1),包含2985个碱基,其中5’端非编码区为200bp,3’端非编码区为1183 bp,开放阅读框1602 bp,编码533个氨基酸。PPARγ基因和PPARα基因类似,也具有4个功能区域:保守性差的N端区域、DNA结合区、可变的铰链区、C端配体结合区;序列比对分析表明,梭鱼和脊椎动物的序列相似性很高,该基因在进化过程中保守。PPARγ基因在被检测的11种组织中均有表达,腹腔肠系膜脂肪中表达量最高,其次是肠、鳃、肾、肝脏、皮肤、脑、脾、胃,心脏和肌肉中表达水平很低。(3)LLPL基因全长cDNA克隆及组织表达分析克隆的梭鱼LPL全长cDNA序列(GenBank:KJ825894.1)包含2395个碱基,5’端非编码区为168 bp,3’端非编码区为676 bp,开放阅读框为1551 bp,编码516个氨基酸。序列比对分析表明,LPL基因可以划分为N末端(24-362位氨基酸残基)和C末端(363-516位氨基酸残基)两个结构区域,一些重要的功能位点如脂肪结合域、催化三联体(Ser-Asp-His)等在进化过程中高度保守。LPLmRNA在所有被检测组织中均有表达,腹腔肠系膜脂肪中表达量最高,其次是肝脏、胃、肾、鳃、肠、脑、心脏、脾脏,在肌肉中表达量较低。(4)FAS基因cDNA部分序列的克隆及组织表达分析克隆的梭鱼FAS基因cDNA部分序列(GenBank:KJ848474.1)长920 bp,编码303个氨基酸。序列分析表明,梭鱼FAS基因和其他物种的该基因相似性为74%～95%。FAS基因mRNA在梭鱼被检测组织中表达丰度差异显著(P<0.05),脑中含量最高,其次是肝脏和腹腔肠系膜脂肪组织,肌肉中表达量最低,其余7种组织中的表达量均显著低于脑和肝脏(P<0.05)。4.饲料脂肪水平对梭鱼脂代谢相关基因表达和酶活性的影响饲养方案同1。结果表明:肝脏中PPARα基因mRNA的丰度随脂肪水平的升高而升高(P<0.05),腹腔肠系膜脂肪和肌肉中PPARα基因mRNA表达量随脂肪水平的升高无显著变化(P>0.05)。肌肉、肝脏、肠系膜脂肪组织中PPARγ基因mRNA表达丰度在脂肪水平增加时有升高趋势,但三种组织中各组间均差异不显著(P>0.05)。腹腔肠系膜脂肪和肌肉中LPLmRNA、FAS mRNA表达量各组之间差异均不显著(P>0.05)。肝脏中LPL mRNA的丰度随脂肪水平的升高显著升高(P<0.05),12.01%和14.59%两组表达水平显著高于2.04%、4.83%和7.47%三组(P<0.05);肝脏中LPL酶活性也随脂肪水平的升高表现出相同的变化趋势,14.59%组酶活性显著高于2.04%和4.83%组(P<0.05)。随着饲料脂肪水平的升高,肝脏中FAS mRNA的表达丰度显著下降(P<0.05),12.01%和14.59%两组均显著低于2.04%组(P<0.05),其余三组之间差异不显著(P>0.05);肝脏中FAS酶活性随脂肪水平的升高也显著下降,14.59%组显著低于2.04%和4.83%组(P<0.05)。5.饲料蛋白水平对梭鱼体脂蓄积、肝脏抗氧化性能、脂代谢相关基因表达和酶活性的影响配制蛋白含量分别为26%、28%、30%、32%的四组等能等脂(总能12.48 土0.10 MJ/kg;脂肪水平5.13±0.12%)饲料,配方中采用玉米淀粉补充蛋白浓度降低导致的能值缺失。均重92.20±4.23 g的梭鱼随机分到工业化养殖池中,随机分为4组,每组3个重复,每个水池2300kg(约25000尾鱼),分别投喂以上4种不同蛋白水平的饲料,养殖周期60 d,试验结束后饥饿24h,取样,测定。结果显示:肌肉、肝脏和肠系膜脂肪组织脂肪蓄积量占鱼体总脂的比例分别为23.29%～24.98%、3.30%～4.27%、7.11%～12.75%,各蛋白水平组间差异不显著(P>0.05),三种组织中均以26%蛋白水平组脂肪蓄积比例最高。肝脏谷胱甘肽过氧化物酶(二次性,P=0.012)和总超氧化物歧化酶(二次性,P=0.014)活性随饲料蛋白水平的升高先增加后下降;26%蛋白组丙二醛含量显著高于其余三组(P<0.05);各组间总抗氧化能力、过氧化氢酶活性差异不显著(P>0.05)。随蛋白水平的增加,肌肉中PPARα基因mRNA表达水平先降低后升高,肠系膜脂肪中变化趋势和肌肉中相似,均以30%蛋白组表达水平最低(P<0.05);肝脏组织中各组间差异不显著(P>0.05)。三种组织中PPARγ基因mRNA表达水平均以26%组表达量最高,除肌肉组织中32%蛋白水平组外,各组织中26%组显著高于其它各蛋白水平组。三种组织中FAS mRNA表达水平和酶活性变化趋势一致,随饲料蛋白水平的升高均先降低后升高,各组织中均以26%组FAS mRNA表达水平和酶活性最高,28%和30%组间差异均不显著(P>0.05),然后在32%组又均有所提高。三种组织中LPL mRNA的丰度无显著差异(P>0.05),肠系膜脂肪组织中各组间LPL酶活性差异不显著(P>0.05),肌肉和肝脏中LPL酶活性随蛋白水平的升高呈升高趋势。综上所述,得出如下结论:(1)适宜的脂肪水平可以促进梭鱼的生长,提高生产性能,过高的脂肪水平(12.01%和14.59%)会抑制鱼体生长,降低肝脏的抗氧化能力,还会导致体组织(肌肉、肝脏)及全鱼蓄积较多的脂肪,因此饲料中应避免添加过多的脂肪;随鱼油添加水平的提高,组织中多不饱和脂肪酸尤其是n-3系列有显著提高,和EPA相比,梭鱼幼鱼体组织选择性沉积更多的DHA;梭鱼幼鱼三种脂肪蓄积位点的脂蓄积量占鱼体总脂的比例由高到低依次为肌肉、腹腔肠系膜脂肪组织、肝脏。(2)梭鱼PPARα、PPARγ、LPL、FAS四种基因编码序列保守性良好,在所有被测组织中均有表达,四种基因在不同组织中表达量差异显著。PPARα mRNA在肝脏中高表达,PAPARγ、LPL mRNA在腹腔肠系膜脂肪组织表达量最高,而FAS mRNA在脑、肝脏、腹腔肠系膜脂肪组织中高水平表达。(3)随脂肪水平的升高,脂肪分解基因PPARα和LPL mRNA在肝脏中的表达水平显著提高,LPL的酶活性也显著增加,而脂肪生成基因FAS mRNA表达和酶活性均显著下降。(4)在等能等脂条件下,低蛋白组(26%)和高蛋白组(32%),尤其是前者,上调了组织(肌肉、肝脏、腹腔肠系膜脂肪)生脂基因PPARγ和FAS的mRNA表达及后者的酶活性,也增强了组织脂肪的沉积,两种蛋白水平下,组织中PPARαmRNA表达水平均有提高,而高蛋白水平(32%)较低蛋白水平(26%)显著提高了 LPL的酶活性。蛋白水平试验中梭鱼幼鱼三种脂肪蓄积位点的脂肪蓄积模式和脂肪水平试验相同。