论文部分内容阅读
第一部分构建H1ESCs荧光报告细胞系并优化PGCLCs诱导效率
【目的】由于人早期生殖细胞的不可获得性，通过hPSCs体外向生殖细胞诱导为人类早期生殖细胞的研究提供了体外模型。但是由于人早期原始生殖细胞缺乏特异的表面标记，不易与周围未分化的体细胞区分，所以本实验通过CRISPR-Cas9基因编辑技术在PGCs特异性基因BLIMP1终止密码子前插入一个mKate2红色荧光蛋白基因，用于检测BLIMP1基因的表达情况。在PGCs体外诱导分化的过程中，可以通过流式细胞分析技术或荧光显微镜观察荧光蛋白的表达，以确定PGCs的分化效率，并利用此报告基因细胞系检测不同诱导方案的诱导分化效率以优化PGCs诱导培养体系。
【方法】通过在线软件在BLIMP1基因终止密码子附近设计三对sgRNA，克隆进pX330载体。转染293FT细胞后，对基因组测序确定能够准确造成DNA双键断裂的sgRNA序列。同时我们构建了构建同源重组质粒，在BLIMP1基因5’端同源臂终止密码子前面连接一段T2A-mKate2-LoxP-EF1a-neo-LoxP序列，然后再和BLIMP1基因3’端同源臂进行连接，并对与sgRNA同源DNA区域进行突变避免切割同源重组质粒。用Fugene6转染试剂同时转染sgRNA质粒和同源重组质粒至H1ESCs中，第二天用50μg/mlG418筛选细胞10天，再传800个细胞至10cm培养皿中获得单克隆细胞。用CollagenaseIV消化单克隆至48孔板中，传代至24孔板后提取DNA用PCR法鉴定出正确插入的克隆。再转染CRE酶质粒去除G418抗性基因，同样用PCR方法鉴定出正确克隆并用Sanger测序确定没有点突变。流式细胞术鉴定敲入细胞系的多能性，并用目前报道的PGCLCs诱导体系对诱导培养基和细胞因子浓度进行优化，以获得诱导效率最高的PGCLCs诱导培养体系。用RT-qPCR检测诱导第四天EB(Embryoid Bodies)是否表达PGCs特异基因。
【结果】在第一步敲入经PCR验证后，获得具有G418抗性的正常插入克隆3个，基因编辑成功率为12.5%。转染CRE酶去除G418抗性之后，阳性克隆为13个，Sanger测序未发现点突变，基因编辑成功率为46.4%。流式细胞术鉴定阳性细胞系仍表达POU5F1，SOX2，NANOG等多能性标记。通过GK15培养基预诱导42h之后再用500ng/mlBMP4和10ng/mlLIF的aRB27培养基进行PGCLCs诱导能够将PGCLCs的诱导效率稳定在35%-60%。且第四天EB高表达BLIMP1，SOX17，TFAP2C，NANOS3等PGCs特异性基因。
【结论】本部分通过CRISPR-Cas9基因编辑技术成功在PGCs特异基因BLIMP1终止密码子后敲入一个红色荧光基因，为体外诱导人多能干细胞向PGCs分化提供了实验平台。用该细胞系进一步优化现有的PGCLCs的诱导培养体系，获得了高效率的适合本实验室及细胞的PGCLCs诱导体系。
第二部分TET基因敲除细胞系建立及其向PGCLCs诱导效率的差异
【目的】多能干细胞在体外具有分化为体内所有细胞的能力包括生殖细胞，小鼠多能干细胞在体外已能够分化为卵子和精子样细胞，并能够在体外受精获得存活的后代。人原始生殖细胞是卵子和精子的祖细胞，其发育分化过程中会经历全基因组去甲基和重新甲基化的表观遗传重编程过程，而该过程主要由TET去甲基化酶负责，且这一过程主要在PGCs发育7周以前完成。而由于伦理和材料限制，7周以前的PGCs细胞几乎无法获得，所以体外模拟PGCs发育过程为了解表观遗传重编程机制提供了良好的实验材料。而hESCs诱导的PGCs为我们研究早期生殖细胞表观遗传调控机制带来了新的途径。本部分实验通过CRISPR-Cas9基因编辑技术对TET基因家族进行敲除研究TET基因家族对PGCs诱导分化的影响。
【方法】通过CRISPR-Cas9基因编辑技术在基因敲入H1ESCs细胞系中对TET基因家族进行敲除，并用第一部分建立的BLIMP1-mKate2荧光报告系统检测H1ESCs在体外向PGCs分化过程中PGCLCs的诱导效率，研究TET基因家族对PGCs分化过程中表观遗传调控机制。Dot-blot检测各组细胞5hmC和5mC的含量，同时运用荧光定量PCR和免疫荧光染色检测PGCs特异性基因的表达。运用亚硫酸盐测序检测PGCs特化过程中关键基因SOX17和BLIMP1启动子区域甲基化水平。
【结果】对TET基因家族进行敲除后我们发现TET2，TET3单独敲除及TET2/3同时敲除细胞对PGCLCs的诱导效率没有显著的影响。当有TET1敲除的组合包括TET1，TET1/2，TET1/3敲除后PGCLCs的诱导效率下降，并且TET1/2/3同时敲除的TKO(triple-knockout)细胞系在诱导第四天没有PGCLCs细胞。通过Dot-blot实验发现在有TET1基因敲除后hESCsDNA中5hmC修饰显著下调，但不影响5mC的修饰水平，且PGCs分化过程中关键基因SOX17，BLIMP1，TFAP2C，NANOS3等表达量均低于未进行基因敲除的WT(wild type)细胞系，这些基因在TKO细胞系中的表达显著下调，而TET2和TET3及TET2/3同时敲除细胞系中这些基因的表达和WT组没有显著差异。TET2/3DKOTET1基因杂合突变细胞系和WT组结果一致。免疫荧光染色结果和RT-qPCR结果相一致。亚硫酸盐测序发现TKO细胞系SOX17和BLIMP1基因启动子区域甲基化水平在ESCs状态和诱导第四天EB中均高于WT组。
【结论】本部分实验通过体外PGCs的诱导，研究早期PGCs发育过程中表观遗传调控机制，发现TET去甲基化酶的缺失导致PGCs诱导过程中PGCs分化特异基因SOX17和BLIMP1启动子呈高甲基化状态使SOX17和BLIMP1的表达下调，ESCs无法向PGCs分化。因此TET基因家族在PGCs发育过程中对PGCs分化特异基因SOX17和BLIMP1具有重要的调控作用，且TET1基因在该过程中的作用最为重要。
第三部分外源性及内源性SOX17和BLIMP1的过表达可重建TKO细胞系向PGCLCs诱导
【目的】已有文献报道在多能干细胞中同时过表达SOX17和BLIMP1可促进PGCLCs的诱导分化，通过在TKO细胞系中使用化学小分子诱导的慢病毒方法启动外源SOX17和BLIMP1基因的表达；或运用dCas9-TET1CD技术改变SOX17和BLIMP1基因启动子甲基化水平启动内源性SOX17和BLIMP1的表达重建TKO细胞系向PGCLCs的诱导。
【方法】构建doxycycline(DOX)和trimethoprim(TMP)诱导表达SOX17和BLIMP1的慢病毒质粒，病毒包装后感染TKO和WT细胞系，用G418和puromycin筛选后获得稳定细胞系。通过流式检测过表达SOX17和BLIMP1后PGCLCs的诱导效率，并用荧光定量PCR和免疫荧光染色进一步验证PGCs特异基因及蛋白的表达，亚硫酸盐测序检测SOX17和BLIMP1基因启动子区域甲基化水平。再构建DOX诱导稳定表达dCas9-TET1CD的TKO细胞系，并在SOX17和BLIMP1启动子区域设计sgRNA靶向位点，通过单独转染诱导后用RT-qPCR确定SOX17和BLIMP1表达量最高的sgRNA序列，并将筛选出的sgRNA构建为一条慢病毒质粒，病毒包装感染后筛选稳定细胞系。检测方法和直接过表达SOX17和BLIMP1部分一致。
【结果】在WT细胞系中同时过表达SOX17和BLIMP1可高效率(~90%)的获得PGCLCs细胞，在TKO细胞系中同时过表达SOX17和BLIMP1可以获得70%左右的PGCLCs细胞。荧光定量PCR显示TKO细胞系中内源性的SOX17和BLIMP1表达较低，均为外源性的SOX17和BLIMP1表达，但是其他PGCs特异性基因表达如NANOS3，TFAP2C，NANOG等均表达上调。而SOX17和BLIMP1启动子区域还是呈高甲基化状态。在PGCLCs诱导过程中在运用dCas9-TET1CD技术降低TKO细胞系中SOX17和BLIMP1启动子甲基化修饰之后也能诱导得到PGCLCs细胞。荧光定量PCR和免疫荧光染色结果显示SOX17，BLIMP1，TFAP2C等PGCs特异性基因表达升高，且SOX17和BLIMP1启动子区域甲基化修饰水平低于未加DOX的TKO细胞系，但是仍高于WT组从而导致诱导效率低于WT组。
【结论】PGCs分化过程中TET基因家族对PGCs特异基因SOX17和BLIMP1启动子的表观遗传修饰调控了PGCs的分化，确定了DNA甲基化的表观遗传修饰和转录因子调控间的密切关系，也进一步确定了SOX17和BLIMP1在人PGCs分化过程中具有重要作用。
第四部分鉴定SOX17和BLIMP1启动子甲基转移酶并敲除可重建TKO细胞系向PGCLCs诱导
【目的】在第三部分我们发现在TKO细胞系中过表达或启动内源性SOX17和BLIMP1的表达能够重建PGCLCs的诱导，且因为TKO细胞系SOX17和BLIMP1基因启动子区域被甲基化从而抑制了PGCLCs的分化。人细胞内有三个对基因组DNA进行甲基化修饰的甲基化酶：DNMT1，DNMT3A和DNMT3B，我们通过ChIP-qPCR和CRISPR-Cas9基因编辑技术在本部分探索对SOX17和BLIMP1基因启动子进行甲基化修饰的甲基转移酶，研究表观遗传调控对PGCs特化的作用。
【方法】运用DNMT1，DNMT3A，DNMT3B抗体对WT和TKO细胞系SOX17和BLIMP1启动子区域进行ChIP-qPCR检测，确定对SOX17和BLIMP1启动子区域进行甲基化的甲基转移酶。再用CRISPR-Cas9基因编辑技术对该酶进行敲除，获得QKO(quadruple-knockout)细胞系。将QKO细胞系向PGCLCs诱导，通过流式细胞术检测诱导效率，荧光定量PCR和免疫荧光染色检测PGCs特异性基因和蛋白的表达，Dot-blot检测5hmC和5mC的表达，亚硫酸盐测序检测PGCs特异性基因SOX17和BLIMP1启动子甲基化程度。
【结果】ChIP-qPCR结果显示DNMT3B为对SOX17和BLIMP1启动子区域进行甲基化的甲基转移酶，在TKO细胞系中对DNMT3B基因进行敲除后能够部分恢复PGCLCs的诱导，且PGCs特异性基因表达均上调。免疫荧光染色结果也显示PGCs特异性标记在QKO细胞诱导的PGCLCs中有表达。Dot-blot结果显示QKO细胞系5hmC和TKO细胞系一致仍显著低于WT组，5mC在WT，TKO，QKO三组细胞系之间没有明显差异。亚硫酸盐测序结果显示在PGCs诱导第四天EB中，SOX17和BLIMP1启动子区域甲基化水平在QKO细胞中较TKO细胞降低，但是仍高于WT组。
【结论】在PGCs特化过程中，TET去甲基化酶将SOX17和BLIMP1基因启动子去甲基化从而使细胞向PGCs方向发育，DNMT3B甲基化酶则负责对SOX17和BLIMP1基因启动子进行甲基化，抑制细胞向PGCs方向发育。本部分实验研究了PGCs分化过程中表观遗传修饰对转录因子的调控作用，使我们更加全面的了解PGCs分化的调控机制。
【目的】由于人早期生殖细胞的不可获得性，通过hPSCs体外向生殖细胞诱导为人类早期生殖细胞的研究提供了体外模型。但是由于人早期原始生殖细胞缺乏特异的表面标记，不易与周围未分化的体细胞区分，所以本实验通过CRISPR-Cas9基因编辑技术在PGCs特异性基因BLIMP1终止密码子前插入一个mKate2红色荧光蛋白基因，用于检测BLIMP1基因的表达情况。在PGCs体外诱导分化的过程中，可以通过流式细胞分析技术或荧光显微镜观察荧光蛋白的表达，以确定PGCs的分化效率，并利用此报告基因细胞系检测不同诱导方案的诱导分化效率以优化PGCs诱导培养体系。
【方法】通过在线软件在BLIMP1基因终止密码子附近设计三对sgRNA，克隆进pX330载体。转染293FT细胞后，对基因组测序确定能够准确造成DNA双键断裂的sgRNA序列。同时我们构建了构建同源重组质粒，在BLIMP1基因5’端同源臂终止密码子前面连接一段T2A-mKate2-LoxP-EF1a-neo-LoxP序列，然后再和BLIMP1基因3’端同源臂进行连接，并对与sgRNA同源DNA区域进行突变避免切割同源重组质粒。用Fugene6转染试剂同时转染sgRNA质粒和同源重组质粒至H1ESCs中，第二天用50μg/mlG418筛选细胞10天，再传800个细胞至10cm培养皿中获得单克隆细胞。用CollagenaseIV消化单克隆至48孔板中，传代至24孔板后提取DNA用PCR法鉴定出正确插入的克隆。再转染CRE酶质粒去除G418抗性基因，同样用PCR方法鉴定出正确克隆并用Sanger测序确定没有点突变。流式细胞术鉴定敲入细胞系的多能性，并用目前报道的PGCLCs诱导体系对诱导培养基和细胞因子浓度进行优化，以获得诱导效率最高的PGCLCs诱导培养体系。用RT-qPCR检测诱导第四天EB(Embryoid Bodies)是否表达PGCs特异基因。
【结果】在第一步敲入经PCR验证后，获得具有G418抗性的正常插入克隆3个，基因编辑成功率为12.5%。转染CRE酶去除G418抗性之后，阳性克隆为13个，Sanger测序未发现点突变，基因编辑成功率为46.4%。流式细胞术鉴定阳性细胞系仍表达POU5F1，SOX2，NANOG等多能性标记。通过GK15培养基预诱导42h之后再用500ng/mlBMP4和10ng/mlLIF的aRB27培养基进行PGCLCs诱导能够将PGCLCs的诱导效率稳定在35%-60%。且第四天EB高表达BLIMP1，SOX17，TFAP2C，NANOS3等PGCs特异性基因。
【结论】本部分通过CRISPR-Cas9基因编辑技术成功在PGCs特异基因BLIMP1终止密码子后敲入一个红色荧光基因，为体外诱导人多能干细胞向PGCs分化提供了实验平台。用该细胞系进一步优化现有的PGCLCs的诱导培养体系，获得了高效率的适合本实验室及细胞的PGCLCs诱导体系。
第二部分TET基因敲除细胞系建立及其向PGCLCs诱导效率的差异
【目的】多能干细胞在体外具有分化为体内所有细胞的能力包括生殖细胞，小鼠多能干细胞在体外已能够分化为卵子和精子样细胞，并能够在体外受精获得存活的后代。人原始生殖细胞是卵子和精子的祖细胞，其发育分化过程中会经历全基因组去甲基和重新甲基化的表观遗传重编程过程，而该过程主要由TET去甲基化酶负责，且这一过程主要在PGCs发育7周以前完成。而由于伦理和材料限制，7周以前的PGCs细胞几乎无法获得，所以体外模拟PGCs发育过程为了解表观遗传重编程机制提供了良好的实验材料。而hESCs诱导的PGCs为我们研究早期生殖细胞表观遗传调控机制带来了新的途径。本部分实验通过CRISPR-Cas9基因编辑技术对TET基因家族进行敲除研究TET基因家族对PGCs诱导分化的影响。
【方法】通过CRISPR-Cas9基因编辑技术在基因敲入H1ESCs细胞系中对TET基因家族进行敲除，并用第一部分建立的BLIMP1-mKate2荧光报告系统检测H1ESCs在体外向PGCs分化过程中PGCLCs的诱导效率，研究TET基因家族对PGCs分化过程中表观遗传调控机制。Dot-blot检测各组细胞5hmC和5mC的含量，同时运用荧光定量PCR和免疫荧光染色检测PGCs特异性基因的表达。运用亚硫酸盐测序检测PGCs特化过程中关键基因SOX17和BLIMP1启动子区域甲基化水平。
【结果】对TET基因家族进行敲除后我们发现TET2，TET3单独敲除及TET2/3同时敲除细胞对PGCLCs的诱导效率没有显著的影响。当有TET1敲除的组合包括TET1，TET1/2，TET1/3敲除后PGCLCs的诱导效率下降，并且TET1/2/3同时敲除的TKO(triple-knockout)细胞系在诱导第四天没有PGCLCs细胞。通过Dot-blot实验发现在有TET1基因敲除后hESCsDNA中5hmC修饰显著下调，但不影响5mC的修饰水平，且PGCs分化过程中关键基因SOX17，BLIMP1，TFAP2C，NANOS3等表达量均低于未进行基因敲除的WT(wild type)细胞系，这些基因在TKO细胞系中的表达显著下调，而TET2和TET3及TET2/3同时敲除细胞系中这些基因的表达和WT组没有显著差异。TET2/3DKOTET1基因杂合突变细胞系和WT组结果一致。免疫荧光染色结果和RT-qPCR结果相一致。亚硫酸盐测序发现TKO细胞系SOX17和BLIMP1基因启动子区域甲基化水平在ESCs状态和诱导第四天EB中均高于WT组。
【结论】本部分实验通过体外PGCs的诱导，研究早期PGCs发育过程中表观遗传调控机制，发现TET去甲基化酶的缺失导致PGCs诱导过程中PGCs分化特异基因SOX17和BLIMP1启动子呈高甲基化状态使SOX17和BLIMP1的表达下调，ESCs无法向PGCs分化。因此TET基因家族在PGCs发育过程中对PGCs分化特异基因SOX17和BLIMP1具有重要的调控作用，且TET1基因在该过程中的作用最为重要。
第三部分外源性及内源性SOX17和BLIMP1的过表达可重建TKO细胞系向PGCLCs诱导
【目的】已有文献报道在多能干细胞中同时过表达SOX17和BLIMP1可促进PGCLCs的诱导分化，通过在TKO细胞系中使用化学小分子诱导的慢病毒方法启动外源SOX17和BLIMP1基因的表达；或运用dCas9-TET1CD技术改变SOX17和BLIMP1基因启动子甲基化水平启动内源性SOX17和BLIMP1的表达重建TKO细胞系向PGCLCs的诱导。
【方法】构建doxycycline(DOX)和trimethoprim(TMP)诱导表达SOX17和BLIMP1的慢病毒质粒，病毒包装后感染TKO和WT细胞系，用G418和puromycin筛选后获得稳定细胞系。通过流式检测过表达SOX17和BLIMP1后PGCLCs的诱导效率，并用荧光定量PCR和免疫荧光染色进一步验证PGCs特异基因及蛋白的表达，亚硫酸盐测序检测SOX17和BLIMP1基因启动子区域甲基化水平。再构建DOX诱导稳定表达dCas9-TET1CD的TKO细胞系，并在SOX17和BLIMP1启动子区域设计sgRNA靶向位点，通过单独转染诱导后用RT-qPCR确定SOX17和BLIMP1表达量最高的sgRNA序列，并将筛选出的sgRNA构建为一条慢病毒质粒，病毒包装感染后筛选稳定细胞系。检测方法和直接过表达SOX17和BLIMP1部分一致。
【结果】在WT细胞系中同时过表达SOX17和BLIMP1可高效率(~90%)的获得PGCLCs细胞，在TKO细胞系中同时过表达SOX17和BLIMP1可以获得70%左右的PGCLCs细胞。荧光定量PCR显示TKO细胞系中内源性的SOX17和BLIMP1表达较低，均为外源性的SOX17和BLIMP1表达，但是其他PGCs特异性基因表达如NANOS3，TFAP2C，NANOG等均表达上调。而SOX17和BLIMP1启动子区域还是呈高甲基化状态。在PGCLCs诱导过程中在运用dCas9-TET1CD技术降低TKO细胞系中SOX17和BLIMP1启动子甲基化修饰之后也能诱导得到PGCLCs细胞。荧光定量PCR和免疫荧光染色结果显示SOX17，BLIMP1，TFAP2C等PGCs特异性基因表达升高，且SOX17和BLIMP1启动子区域甲基化修饰水平低于未加DOX的TKO细胞系，但是仍高于WT组从而导致诱导效率低于WT组。
【结论】PGCs分化过程中TET基因家族对PGCs特异基因SOX17和BLIMP1启动子的表观遗传修饰调控了PGCs的分化，确定了DNA甲基化的表观遗传修饰和转录因子调控间的密切关系，也进一步确定了SOX17和BLIMP1在人PGCs分化过程中具有重要作用。
第四部分鉴定SOX17和BLIMP1启动子甲基转移酶并敲除可重建TKO细胞系向PGCLCs诱导
【目的】在第三部分我们发现在TKO细胞系中过表达或启动内源性SOX17和BLIMP1的表达能够重建PGCLCs的诱导，且因为TKO细胞系SOX17和BLIMP1基因启动子区域被甲基化从而抑制了PGCLCs的分化。人细胞内有三个对基因组DNA进行甲基化修饰的甲基化酶：DNMT1，DNMT3A和DNMT3B，我们通过ChIP-qPCR和CRISPR-Cas9基因编辑技术在本部分探索对SOX17和BLIMP1基因启动子进行甲基化修饰的甲基转移酶，研究表观遗传调控对PGCs特化的作用。
【方法】运用DNMT1，DNMT3A，DNMT3B抗体对WT和TKO细胞系SOX17和BLIMP1启动子区域进行ChIP-qPCR检测，确定对SOX17和BLIMP1启动子区域进行甲基化的甲基转移酶。再用CRISPR-Cas9基因编辑技术对该酶进行敲除，获得QKO(quadruple-knockout)细胞系。将QKO细胞系向PGCLCs诱导，通过流式细胞术检测诱导效率，荧光定量PCR和免疫荧光染色检测PGCs特异性基因和蛋白的表达，Dot-blot检测5hmC和5mC的表达，亚硫酸盐测序检测PGCs特异性基因SOX17和BLIMP1启动子甲基化程度。
【结果】ChIP-qPCR结果显示DNMT3B为对SOX17和BLIMP1启动子区域进行甲基化的甲基转移酶，在TKO细胞系中对DNMT3B基因进行敲除后能够部分恢复PGCLCs的诱导，且PGCs特异性基因表达均上调。免疫荧光染色结果也显示PGCs特异性标记在QKO细胞诱导的PGCLCs中有表达。Dot-blot结果显示QKO细胞系5hmC和TKO细胞系一致仍显著低于WT组，5mC在WT，TKO，QKO三组细胞系之间没有明显差异。亚硫酸盐测序结果显示在PGCs诱导第四天EB中，SOX17和BLIMP1启动子区域甲基化水平在QKO细胞中较TKO细胞降低，但是仍高于WT组。
【结论】在PGCs特化过程中，TET去甲基化酶将SOX17和BLIMP1基因启动子去甲基化从而使细胞向PGCs方向发育，DNMT3B甲基化酶则负责对SOX17和BLIMP1基因启动子进行甲基化，抑制细胞向PGCs方向发育。本部分实验研究了PGCs分化过程中表观遗传修饰对转录因子的调控作用，使我们更加全面的了解PGCs分化的调控机制。