大豆(Glycine max)是一种重要的粮食和经济作物,是植物油脂和蛋白的重要来源,在人民生活以及国民经济中具有重要的地位。近年来,我国大豆进口依存度居高不下,产业安全面临危机和挑战,在此背景下,分离生物及非生物胁迫抗性功能基因,明确其遗传关系及分子调控网络,进而利用分子设计育种培育高产耐逆的大豆优良品种显得尤为重要。NAC类转录因子是植物特有的转录因子家族,己发现大量NAC类转录因子能够通过直接转录调控胁迫相关基因的表达参与植物胁迫响应,调控植株耐逆性,成为植物非生物胁迫和生物胁迫耐逆性改良的有效靶点。实验室之前通过大豆盐胁迫下的转录谱分析获得了一个盐诱导型大豆NAC转录因子基因GmSIN2,发现其过表达转基因大豆在田间产量性状及耐盐性显著优于对照,为了进一步研究其在大豆胁迫耐受性中的功能和作用机制,通过酵母cDNA文库筛选得到GmSIN2的候选互作蛋白GmNIW(NACInteractive WD40protein),后者编码WD40蛋白,其功能在大豆中尚属未知。在此基础上,本论文以GmSIN2和GmNIW为研究对象,进行了以下研究并获得了相应的结果:1.确认GmSIN2和GmNIW在植物体内存在蛋白相互作用利用双分子荧光互补(BiFC)实验确认了 GmSIN2和GmNIW在植物体内的蛋白相互作用,初步判断其互作部位在细胞核。2.GmNIW和GmSIN2基因特性的系统比较通过系统进化分析,发现大豆基因GmNIW直系同源基因广泛存在于藻类到被子植物的各个代表物种且加倍较少,说明其基因古老且功能保守,而GmSIN2直系同源基因在藻类中不存在,藓类到被子植物中都有发现,且加倍较多见,说明其出现较晚且基因功能易发生分化;通过器官特异性表达模式分析,发现GmNIW和GmSIN2具有不同的器官特异性表达,叶和花是它们共同高表达的部位;通过胁迫响应表达模式分析,发现GmSIN2受NaCl,H202和MeJA的短期强烈诱导表达,而GmNIW在NaCl胁迫下短期上调表达,而在H202和MeJA处理下呈微弱下调趋势。3.GmNIW和GmSIN2在植物非生物胁迫和生物胁迫响应中的功能为了研究GmNIW和GmSIN2在植物胁迫响应中的功能,分别构建了它们的植物过表达载体及CRISPR-CAS9突变体载体,通过农杆菌转化获得了它们异位表达的转基因拟南芥(Arabidopsis thaliana)纯系、35Spro::GmSIN2-GFP转基因大豆T2 代,35Spro::GmNIW-GFP转基因大豆T1代,并利用转基因拟南芥/大豆初步研究了它们在非生物胁迫和生物胁迫中的功能。发现GmNIW和GmSIN2异位表达的转基因拟南芥灰霉抗性和耐盐性均提高;不同于GmSIN2异位表达的转基因拟南芥显示出的根长对于ABA和H202敏感性下降,GmNIW异位表达的拟南芥对ABA和H202敏感性变化不明显。这说明耐盐性和灰霉抗性可能是GmNIW和GmSIN2共同调控的主要生物学途径。另一方面,发现35Spro::GmSIN2转基因大豆在田间干旱胁迫下的生长状况优于野生型,说明除提高耐盐性外,GmSIN2也能够提高大豆耐旱性,GmNIW是否也能调控大豆耐旱性有待进一步研究。4.GmNIW和GmSIN2协同调控胁迫抗性的途径初探为了进一步研究GmNIW和GmSIN2共同调控的分子途径,探讨它们参与大豆非生物和生物胁迫抗性的可能机制,分别对GmMIW、GmSIN2过表达转基因大豆以及野生型大豆进行了RNA-seq实验,并进行了差异基因的GO terms富集、KEGG pathway富集及互作网络预测。结果发现在GmNIW过表达大豆中,下调基因的数量远大于上调基因数量,其中植物-病原菌互作、胁迫响应等途径显著上调表达,植物激素信号途径、信号传导及转录调控类蛋白在上调和下调类目中均有显著富集,而细胞基础物质与能量代谢相关途径显著下调,同时在差异基因中发现多个由植物防御途径、ABA、JA等途径相关组分构成的互作网络;而在GmSIN2过表达大豆中,上调基因数目远大于下调基因数目,其中生物胁迫响应、植物-病原菌互作、激素信号传导、JA合成代谢等途径显著上调,而部分细胞基础物质与能量代谢相关途径下调;这些结果说明GmNIW和GmSIN2可能均参与以生物胁迫响应为主的植物胁迫响应过程,而JA途径可能是它们共同调控的植物激素途径。通过分析RNA-seq结果中JA合成与信号传导关键基因的表达模式,发现在GmNIW过表达大豆中,相关基因均下调,而在GmSIN2过表达大豆中,相关基因均上调。进一步的Real-time RT-PCR 实验验证了 JA 合成关键基因Glyma.18G280900.1(GmAOC1),Glyma.19G044900.1(GmAOC2),Glyma.13G047300.1(GmAOC4)及JA 信号传导关键基因Glyma.13G112000.1(GmJAZ2)在GmSIN2过表达大豆中的显著性上调表达和在GmNIW过表达大豆中的显著性下调表达,说明GmNIW和GmSIN2以相反的形式调控JA合成与信号传导相关基因的表达。上述结果表明,GmSIN2及其互作蛋白GmNIW编码基因在进化起源、器官特异性表达上具有各自的特点,它们都在转录水平以不同形式响应NaCl、H2O2及MeJA,在植物中参与耐盐性与灰霉抗性调控,并都影响生物胁迫等相关基因的表达,以相反的模式调控JA合成及信号传导关键基因的表达,它们可能通过调节JA途径参与植物生物及非生物抗性调控。