紫丁香主要活性成分制备及抗氧化应激活性评价

来源 :东北林业大学 | 被引量 : 3次 | 上传用户:caozhi7963
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紫丁香(Syringa oblata Lindl.)为我国北方常见园林绿化树种,分布于我国西南、华北、东北大部分地区。自古以来民间就用其治疗腹泻、肝炎等疾病。其茎内紫丁香苷、橄榄苦苷等活性成分含量丰富,兹待进一步开发利用。此外,羟基酪醇(HT)作为一种抗氧化性极强的天然植物活性成分,被广泛应用于食品、化妆品、保健品、医药等领域。其主要来自于橄榄压榨厂废水或从橄榄果汁中提取,原料有限且将其从众多的酚类化合物中分离出来至今仍是个难题。因此,本文以广泛种植的紫丁香替代国家保护植物刺五加来制备紫丁香苷,同时制备出橄榄苦苷,并对分离出的橄榄苦苷首次采用离子交换树脂作为固体酸水解制备羟基酪醇,替代了传统的无机酸水解工艺,使过程更清洁,污染降低。所得到的主要研究结果如下:1.建立了紫丁香中紫丁香苷、橄榄苦苷定量分析方法和高效真空微波提取方法(1)确定了 RP-HPLC同时测定紫丁香小枝中紫丁香苷、橄榄苦苷的色谱条件:流动相为甲醇:0.2%磷酸=33:67;检测波长:232 nm;柱温:室温;进样量:10 μL;流速:1 mL/min。紫丁香苷、橄榄苦苷在测定范围内,线性关系良好。该分析方法精密度高、重现性好、准确可靠。为紫丁香中紫丁香苷、橄榄苦苷的开发提供了快速、准确的定量测定方法。(2)采用非常规的真空微波法对紫丁香小枝中的紫丁香苷、橄榄苦苷进行了提取,在单因素实验的基础上对提取过程中的各因素采用响应面法进行了优化,得到最佳真空微波提取工艺条件为:提取时间7 min,液料比20 mL/g,乙醇浓度42%,微波功率120 W,真空度-0.08 MPa,浸泡时间J h。最佳条件下的验证实验表明,紫丁香苷、橄榄苦苷的提取得率分别可达到5.16 mg/g和3.52 mg/g。与传统提取方法相比,除了缩短提取时间外,还可保护热敏感组分免受高温损害,提高目标组分提取得率。2.对紫丁香小枝中紫丁香苷、橄榄苦苷的分离富集进行了研究(1)通过比较研究11种大孔树脂对紫丁香小枝提取液中紫丁香苷、橄榄苦苷的吸附、解吸性能,筛选出HPD-100B树脂作为分离富集两种目标组分的理想树脂。(2)确定了 HPD-100B大孔树脂最佳吸附系列参数:上样液浓度,紫丁香苷:435μg/mL,橄榄苦苷:422 μg/mL;吸附温度25 ℃;上样液流速3 BV/h;饱和吸附量紫丁香苷为12.2 mg/g树脂,橄榄苦苷为51.5 mg/g树脂;此外,还发现紫丁香苷吸附泄漏点至橄榄苦苷吸附泄漏点出现之间的吸附流出液(15BV-60BV)中含有大量的紫丁香苷,而基本不含橄榄苦苷,所以可将此部分收集,进行进一步分离纯化紫丁香苷。此部分紫丁香苷含量为34.4 mg/g树脂。(3)确定了 HPD-100B大孔树脂最佳解吸系列参数:解吸采用20%和40%乙醇梯度洗脱,其中20%乙醇洗脱部分收集7 BV,40%乙醇洗脱部分收集9 BV,可将吸附的紫丁香苷、橄榄苦苷分别洗脱下来;洗脱流速3 BV/h;紫丁香苷、橄榄苦苷过大孔树脂后的纯度分别为7.2%和14.2%,分别为过柱前的7.1和8.2倍,且回收率分别为77.4%和 89.8%。3.分别对紫丁香苷、橄榄苦苷粗品的硅胶柱层析条件分别进行了考察,最终确定两目标组分的柱层析条件如下:(1)紫丁香苷:最佳洗脱剂比例为乙酸乙酯:甲醇:水-12:1:0.2,硅胶粒度为100-200目,径高比1:10,洗脱流速0.6 cm/min,负载量为25 mg粗提物/g硅胶,最终得紫丁香苷纯度可达92%,回收率达78%。(2)橄榄苦苷:最佳洗脱剂比例为乙酸乙酯:甲醇:水-16:1:0.2,硅胶粒度为100-200目,径高比1:10,洗脱流速0.6 cm/min,负载量15 mg粗提物/g硅胶,最终得橄榄苦苷纯度可达86%,回收率达85%。4.进行了离子交换树脂催化橄榄苦苷制备羟基酪醇工艺参数的研究(1)通过8种阳离子交换树脂对橄榄苦苷粗品溶液水解性能的考察,优选出001*7、D72、D61三种强酸性SO3-离子交换树脂,对其水解-解吸动力学等进一步考察确定001*7为最优树脂。(2)通过静态水解、解吸实验确定了 001*7树脂水解橄榄苦苷的最佳工艺条件为:水解-解吸温度70 ℃,水解时间2 h,树脂载样量为4%(w/v,树脂重/溶液体积),橄榄苦苷粗品溶液浓度为574.2μg/mL,洗脱剂为80%乙醇,解吸时间1h。(3)采用001*7树脂柱对橄榄苦苷粗品溶液进行水解后,橄榄苦苷水解率达96.37%,显著高于静态水解的81.6%。用强酸型阳离子交换树脂催化水解橄榄苦苷,具有较高活性,提供了一种新的由橄榄苦苷制备羟基酪醇的方法,该方法中离子交换树脂可重复利用且反应条件温和,稳定性好,所用溶剂安全无毒,避免了盐酸水解所存在的酸污染和难分离等问题,具有较好的应用前景。5.羟基酪醇、橄榄苦苷对H2O2诱导的LLC-PK1细胞氧化应激损伤保护作用评价(1)以100 μM H2O2处理4h成功创建LLC-PK1细胞的氧化应激损伤模型。(2)羟基酪醇(2 μM)、橄榄苦苷(1OμM)能有效的降低细胞内MDA表达和提高细胞内SOD、GSH-Px的活性,从而预防和阻止自由基对肾细胞的损伤达到保护肾细胞的作用。(3)H2O2模型组细胞脂肪酸组成发生改变,不饱和脂肪酸相对含量显著降低。羟基酪醇、橄榄苦苷均表现出明显的抑制氧化应激LLC-PK1细胞脂肪酸转化的作用。羟基酪醇、橄榄苦苷对H2O2诱导的LLC-PK1细胞氧化应激具有抑制活性,且羟基酪醇优于橄榄苦苷。
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