【摘 要】
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目的:探讨TIMP-1是否影响高糖诱导的肾小球系膜细胞凋亡及其作用机制。方法:1)大鼠肾小球系膜细胞分别经含5mmol/L、10 mmol/L、20 mmol/L、30 mmol/L、40 mmol/L葡萄糖及含3
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目的:探讨TIMP-1是否影响高糖诱导的肾小球系膜细胞凋亡及其作用机制。方法:1)大鼠肾小球系膜细胞分别经含5mmol/L、10 mmol/L、20 mmol/L、30 mmol/L、40 mmol/L葡萄糖及含30mmol/L甘露醇的1640培养基培养24h、48h、72h后用流式AnnexinV/PI双染法检测凋亡率。2)用脂质体将正、反义人TIMP-1及空载体转染到肾小球系膜细胞中,建立体外的人TIMP-1高表达和低表达系统。PCR检测人TIMP-1的整合;RT-PCR检测人TIMP-1的表达及转染人 TIMP-1后对大鼠内源性鼠TIMP-1表达的影响。3)描绘各组细胞的生长曲线。4)高糖刺激24小时后丫啶橙染色,荧光显微镜下观察。5)用含30mmol/L葡萄糖的1640培养液作用系膜细胞24h。RT-PCR检测bax和bcl-2的表达;CaspACETM Assay System,Colorimetic试剂盒检测Caspse-3的蛋白活性。结果:1)高糖以剂量-时间依赖的方式诱导大鼠肾小球系膜细胞凋亡,P<0.05,相关系数分别为R2=0.925,R2=0.9867。甘露醇不能诱导大鼠肾小球系膜细胞凋亡,P>0.05.2)PCR及RT-PCR鉴定结果:转染正、反义TIMP-1及空载体组均可表达neor基因;而只有转染正、反义TIMP-1组能够表达人TIMP-1<WP=5>基因。反义TIMP-1组大鼠内源性鼠TIMP-1表达减少,而其他组则无明显变化。3)生长曲线结果:转染正义TIMP-1组生长最快,而转染反义TIMP-1组则生长最慢,空载体组和未转染组居中。4)丫啶橙染色结果显示:转染正义TIMP-1系膜细胞组几乎无凋亡细胞;转染反义TIMP-1系膜细胞组凋亡细胞最多;空载体组及未转染组居中。5)高糖作用24h后,RT-PCR结果:转染正义TIMP-1组bax的表达下降,而转染反义TIMP-1组bax表达增高,空载体组及未转染组无明显变化。Caspse-3活性检测结果:转染正义TIMP-1组Caspase-3活性明显下降,而转染反义TIMP-1组Caspase-3活性明显增高,转染空载体组和未转染组则无明显变化P<0.01。结论:1)高糖能够以剂量-时间依赖的方式诱导大鼠系膜细胞凋亡。高渗无诱导凋亡的作用。2)TIMP-1能够促进肾小球系膜细胞的生长,并通过抑制Bax、Caspase-3经典的细胞凋亡途径来抑制凋亡。
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