基于重组MBL蛋白快速富集血流感染病原菌方法的建立

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目的:甘露糖结合凝集素(mannose-binding lectin,MBL)是肝脏产生的一种血清C型凝集素,在Ca2+参与下可与细菌、真菌、病毒等微生物表面的特异性糖基结合,本研究拟以甘露糖结合凝集素糖识别域(CRD)为基础,通过制备重组人MBL(rhMBL)蛋白、MBL全长蛋白,建立不依赖血培养的基于rhMBL蛋白-磁珠的快速富集血流感染病原菌的实验室操作流程。方法:复苏本实验室高效表达rhMBL(M1)、MBL全长蛋白(M2)的细胞株,用无血清培养基培养并利用His标签蛋白纯化试剂盒纯化细胞培养上清中的蛋白。Native PAGE检测目的蛋白非还原状态下的结构,SDS-PAGE检测目的蛋白表达量,Western Blot鉴定目的蛋白,BCA法测定蛋白浓度。通过Western Blot检测M1/M2蛋白与假丝酵母菌直接结合的情况,然后通过流式细胞术比较M1/M2蛋白与假丝酵母结合度。M1蛋白包被protein A磁珠富集病原菌(以下简称M1方法),M2蛋白包被链霉亲和素磁珠富集病原菌(以下简称M2方法),首先在PBS模拟样本中富集假丝酵母菌,比较两种蛋白-磁珠复合体对假丝酵母菌的富集效率。然后富集血流感染兔血模拟样本的假丝酵母菌,并与血流感染诊断的金标准—血培养比较鉴定病原菌所需时间(TTIC,the time to obtain individual colonies,即自样本处理开始至生长至适合于MALDI-TOF MS鉴定菌落大小所需时间)。最后建立血液新型隐球菌基于M1磁珠的快速检测方法。通过Western Blot检测M1蛋白与新型隐球菌直接结合的情况,然后由M1方法在PBS模拟样本与兔血模拟样本中富集新型隐球菌,最后比较三种不同方法(方法1,M1方法富集后直接进行RT-PCR鉴定;方法2,M1方法富集后培养加质谱鉴定;方法3(金标准),血培养加质谱鉴定)检测血液新型隐球菌的优劣。最后通过Western Blot检测M1蛋白与脓毒症常见细菌铜绿假单胞菌、粘质沙雷菌、鲍曼不动杆菌、嗜麦芽假单胞菌、表皮葡萄球菌、脑膜炎奈瑟菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌、阴沟肠杆菌、金黄色葡萄球菌、A型溶血性链球菌、粪肠球菌、肺炎链球菌标准株与临床株直接结合的情况,为建立血流感染常见细菌基于M1蛋白的快速检测方法奠定基础。结果:His标签亲和层析纯化得到纯度大于95%的M1、M2蛋白,经检测M1蛋白分子量约为49 KDa,M2蛋白分子量约为32 KDa。超滤后M1蛋白的浓度为476.8μg/mL,M2蛋白的浓度为691.5 μg/mL。Native PAGE检测非还原条件下目的蛋白的聚合形式,结果显示自然条件下M1蛋白自然条件下以6个单体聚合的形式存在,M2蛋白自然条件下并非以单一的多聚体形式存在,而是以三聚体(9个单体聚合)、四聚体(12个单体聚合)、五聚体(15个单体聚合)三种形式存在。M1、M2蛋白与血流感染常见假丝酵母菌的标准株与临床株普遍结合,但M1蛋白的结合能力大于M2,因此我们认为MBL蛋白CRD区与微生物表面糖类的结合力不仅取决于CRD区的聚合程度,还取决于CRD区聚合形成的空间结构。M1方法可以富集浓度≤1 CFU/mL兔血模拟样本中的病原菌。M1蛋白与新型隐球菌标准株与临床株普遍结合,但结合能力略有差异。M1方法富集后直接通过RT-PCR鉴定所需时间最短,为4.25 h,但其鉴定的灵敏度仅至10CFU/mL。后两种方法检测的灵敏度均≤1 CFU/mL,但耗时较长,尤其血培养的鉴定时间达109-120 h。M1蛋白与血流感染常见细菌标准株均能结合,但与细菌临床株结合条带大小不一,结合能力存在差异,特别是表皮葡萄球菌的部分临床株与M1蛋白无结合条带或结合能力较低,说明临床株普遍能与M1蛋白结合,但结合力存在差异。结论:M1、M2蛋白与血流感染常见假丝酵母菌普遍结合,但M1蛋白的结合能力大于M2。M1蛋白与新型隐球菌、血流感染常见细菌标准株与临床株普遍结合,但结合能力略有差异。基于此,建立不依赖血培养的M1方法快速富集血流感染病原菌的实验室操作流程。通过以上实验结果,以及MBL对病原菌的广谱结合能力,我们认为使用M1方法富集病原菌对病原菌血流感染的诊断有重要的临床实用价值。
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