论文部分内容阅读
随着水产养殖业的发展,细菌性疾病频发,目前针对细菌性疾病的防治主要为采用抗菌药物抑制病原菌,造成了环境污染及细菌耐药性增加等问题。疫苗作为一种高效、环保的生物制品,是防控病原微生物引发的各类疾病的重要手段。本团队从重庆任河水体及病鱼中分离出两株病原菌,本试验拟从两株细菌的分离与鉴定、对鲫（Carassius auratus）的致病试验及灭活疫苗对鲫的免疫作用和免疫保护效应方面进行研究:1.从水体和病鱼的鳃和皮肤病灶分离出两株病原菌,命名为JS-1和JW-4。进行形态鉴定、生理生化鉴定以及16S rDNA分子鉴定后,证明细菌JS-1为松鼠葡萄球菌（Staphylococcus sciuri）,JW-4为维氏气单胞菌（Aeromonas veronii）,系统发育分析显示JS-1与松鼠葡萄球菌聚为一支,JW-4与维氏气单胞菌聚为一支。药敏试验显示JS-1对苯唑西林、头孢他啶、新霉素和呋喃唑酮耐药,JW-4对青霉素、苯唑西林、氨苄西林、羧苄西林、呋喃唑酮和麦迪霉素耐药,对其他药敏纸片敏感或中度敏感。结果表明,两株细菌的耐药性较强。2.经过急性毒性试验确定两株细菌的96 h LD50后,根据两株细菌的LD50（JS-1为5×10~6cell/ml,JW-4为2×10~6cell/ml）,每株细菌设定四个试验组,分别为对照组（CG,0 cell/g饲料）、低浓度组（LG,10~4cell/g饲料）、中浓度组（MG,10~5cell/g饲料）和高浓度组（HG,10~6cell/g饲料）,每组设三个平行,拌饲投喂鲫,投喂量为鲫体重的2%,进行为期28天的饲养实验。测定JS-1和JW-4两株细菌所有浓度组血清和肝脏中溶菌酶（lysozyme,LZM）、谷草转氨酶（glutamic oxalacetic transaminase,GOT）、谷丙转氨酶（glutamic pyruvic transaminase,GPT）活性,进行CG和MG组肝脏、脾脏和肾脏的组织病理学观察并测定肝脏和脾脏的TNF-α和IFN-γ基因表达量。结果发现:与对照组相比,两株菌处理后血清和肝脏中LG、MG和HG组GOT、GPT活性均呈先增加后减少的趋势,LZM呈增加趋势。投喂添加不同浓度JS-1饲料的试验中,第1天时HG组血清GOT、GPT活性显著高于CG组（p<0.05）,MG组血清LZM、肝脏GOT显著高于CG组;第7天时LG组血清LZM、肝脏GOT活性显著高于CG组（p<0.05）;第14天时,HG组血清LZM活性显著高于CG组（p<0.05）,MG和HG组肝脏GOT活性显著低于CG组;第21天时,MG组肝脏GOT活性显著低于LG组;第28天时,LG组血清GPT显著低于MG组（p<0.05）,LG组血清LZM活性显著高于CG组（p<0.05）。投喂添加不同浓度JW-4饲料的试验中,第1天时肝脏中LG组GOT活力显著高于CG组（p<0.05）;第7天时,HG组血清GPT显著高于LG组（p<0.05）,HG组肝脏GOT活性显著高于其他3组（p<0.05）,MG组肝脏GPT活性显著高于CG组（p<0.05）;第14天时,LG组血清LZM活性显著高于CG组（p<0.05）,LG和MG组的肝脏GOT、GPT活性显著低于CG组（p<0.05）;第21天时,LG组血清GPT活性显著低于CG组（p<0.05）,HG组血清LZM活性显著高于CG组（p<0.05）,HG组肝脏GOT和GPT活性显著低于CG组（p<0.05）;第28天时,血清中CG组GOT、GPT活性显著高于其他3组（p<0.05）,LG和HG组血清LZM活性显著高于CG组,HG组肝脏GOT活性显著低于CG组（p<0.05）。组织病理学观察显示,鲫的肝脏、脾脏和肾脏均出现不同程度的病变。经细菌JS-1处理后,MG组鲫肝脏细胞核不规则,细胞空泡化;脾脏充血严重,局部坏死;肾脏中肾小囊间隙增大,肾小体肿胀。经细菌JW-4处理后,MG组鲫肝脏局部坏死,细胞核碎裂、溶解;脾脏实质内淋巴细胞和其他细胞排列不规则、细胞核变形;肾脏中肾小管和肾小球的细胞之间界限不分且细胞核形状变化。TNF-α和IFN-γ基因表达量趋势均为先增加后降低,并在14天时表达量达到顶峰,14天时JS-1和JW-4的MG组与CG组相比均显著增加（p<0.05）。结果表明,JS-1和JW-4对鲫的致病性强,使鲫器官出现不同程度的损伤,并能刺激非特异性免疫基因的表达。3.根据两株细菌的96 h LD50设置JS-1、JW-4和CG三个试验组,每组三个平行。JS-1和JW-4试验组分别注射10~7cell/ml细菌加弗氏完全佐剂制成的灭活疫苗100μl,CG组注射等量生理盐水。测定血清和肝脏中碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,AKP）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）、过氧化氢酶（catalase,CAT）、LZM、GOT、GPT活性,肠道中α-淀粉酶、脂肪酶活性,并测定血清中特异性IgM含量和总IgM含量。灭活疫苗免疫28天后,注射10倍疫苗浓度的活菌100μl,测定免疫保护率。结果表明,鲫经JS-1灭活疫苗免疫后,第1天时肝脏CAT活性显著低于CG组（p<0.05）;第7天时,血清GOT活性,GPT活性和肝脏GPT活性显著低于CG组（p<0.05）,血清CAT活性显著高于CG组（p<0.05）;第14天时,血清GOT,血清SOD,肝脏AKP和肝脏GPT活性显著低于CG组（p<0.05）,血清CAT活性显著高于CG组（p<0.05）;第21天时,血清GOT和肝脏AKP活性显著低于CG组（p<0.05）,肠道脂肪酶活性显著高于CG组（p<0.05）;第28天时,血清GOT、肝脏GPT和肝脏AKP含量显著低于CG组（p<0.05）,血清LZM、肠道淀粉酶和肠道脂肪酶活性显著高于CG组（p<0.05）。鲫经JW-4灭活疫苗免疫后,第1天时,血清CAT活性显著高于CG组（p<0.05）;第7天时,血清LZM和CAT活性显著高于CG组（p<0.05）,血清AKP、GOT和GPT活性显著低于CG组（p<0.05）;第14天时,血清AKP和GPT活性显著低于CG组（p<0.05）;第21天时,血清中CAT活性和肠道淀粉酶活性显著高于CG组（p<0.05）,肝脏GPT活性显著低于CG组（p<0.05）;第28天时,血清和肝脏中LZM活性显著高于CG组（p<0.05）,血清AKP、肝脏GOT和肝脏GPT活性显著低于CG组（p<0.05）。肝脏SOD活性各组之间均无显著性差异（p>0.05）。注射JS-1和JW-4灭活疫苗后特异性IgM和总IgM含量与CG组相比均显著增加（p<0.05）。进行回归感染试验后10天内JS-1组免疫保护率为83.3%,JW-4组免疫保护率为75%,与CG组相比差异显著（p<0.05）。结果表明,JS-1和JW-4灭活疫苗对鲫无毒,还能刺激鲫机体的免疫反应,且能使鲫产生特异性抗体。以上结果表明,投喂拌有不同浓度的松鼠葡萄球菌JS-1与维氏气单胞菌JW-4的饲料对鲫均有较强的毒性,会使鲫的器官发生明显的病变反应。两株细菌的灭活疫苗对鲫机体无害,且会一定程度上促进鲫的免疫应答和消化能力,结合IgM的含量和免疫保护率,说明JS-1和JW-4能促进机体抗体的产生,并且能在感染病原菌后达到保护鲫的效果。综合两株细菌的致病作用及灭活疫苗的有效性,可为水产养殖中细菌性疾病的防治提供理论基础。