论文部分内容阅读
牛环形泰勒虫病是由环形泰勒虫（Theileria annulata）寄生于牛的红细胞、巨噬细胞和淋巴细胞内引起的以贫血、稽留热为主要临床症状的一种蜱传血液性原虫病。迄今为止，还没有防治环形泰勒虫病的特效药物，由于新疆特殊的地理环境条件，媒介蜱分布广而多，该病的发病率在我区呈逐年上升趋势，严重影响了养牛业的发展。因此，在牛环形泰勒虫病的防控工作中，在筛选病原表面抗原靶基因的基础上，研发高灵敏度及高通量的检测技术就显得尤为重要。本研究进行了如下三方面的研究工作：（ⅰ）本研究，根据GenBank中已发表的牛环形泰勒虫Tams1基因序列，设计合成5对引物，采用基因工程技术分别扩增Tams1基因的全长基因（AE）、无N端及C端疏水区（BC）、仅缺乏N端疏水区（BE）片段，从而构建原核表达重组质粒。结果显示：成功地扩增了Tams1基因的AE、BC、BE等片段，构建了pGEX-4T-2-BE，pGEX-4T-2-BC，pGEX-4T-2-AE、pET-28a-BC，pET-28a-BE，pET-30a-BC，pET-30a-BE等7种原核表达重组质粒；测序结果表明克隆的Tams1序列及推导氨基酸序列与已发表的其它国家的虫株序列同源性可达99%，但与我国甘肃株的同源性分别为92%和86%，本实验可为用精制抗原诊断环形泰勒虫病的研究奠定基础。（ⅱ）本研究经基因工程方法，将重组质粒转化宿主菌BL21（DE3）后，采用IPTG诱导法表达融合蛋白，并采用SDS-PAGE电泳法分析比较各蛋白的表达形式和表达量，对含筛选的高效可溶性表达质粒的重组菌进行诱导条件优化，最终对纯化的蛋白进行Western blotting检测。实验结果表明：成功表达出6种融合蛋白；SDS-PAGE检测筛选得出含pGEX-4T-2-BC（无疏水区靶基因）和pET-30a-BE（含C端疏水区靶基因）质粒的重组菌可分别高效表达GST-BC（53ku）和His-BE（32ku）的可溶性蛋白；Western blotting表明纯化的GST-BC和His-BE融合蛋白具有良好的反应原性，可作为诊断抗原。（ⅲ）本实验，以纯化后的His-BE蛋白作为包被抗原，通过优化其反应条件后较成功地建立了检测牛环形泰勒虫抗体的间接ELISA方法；并进行了其敏感性、特异性、重复性等评测试验，应用建立的方法检测了样品（N=250）。结果显示：最佳抗原包被浓度为3μg/mL，包被时间为4℃过夜；最佳封闭液为3%脱脂乳；血清和酶标二抗的稀释度分别为1:100和1:12000，封闭时间、血清作用时间和酶标抗体孵育时间都为1h；底物作用时间为20min；临界值为0.221。本试验所建立的间接ELISA方法具有一定的敏感、特异性，无交叉反应，其变异系数小于10%；应用建立的ELISA方法对吐鲁番地区的250份牛疑似血样进行了检测，结果显示环形泰勒虫感染率为39.2%，这结果被Western blotting检测方法验证，符合率为96.7%。该参数可为我区牛环形泰勒虫病的防治奠定基础。