由葡萄座腔菌(Botryosphaeria dothidea)侵染苹果引起的苹果轮纹病,是我国苹果生产上危害最为严重的病害之一。已有研究表明,葡萄座腔菌侵染苹果枝条形成小瘤或溃疡病斑,但其侵染过程和致病机理尚不清楚。本文首先利用共聚焦激光扫描显微镜和扫描电子显微镜观察了葡萄座腔菌侵染苹果枝条的过程,确定了主要侵染阶段。然后,利用二代测序技术获得了葡萄座腔菌的基因组和转录组数据,分析了葡萄座腔菌侵染苹果枝条过程中,病原菌致病相关基因和苹果抗病基因在各主要侵染阶段的表达情况。最后,鉴定了葡萄座腔菌低致病力菌株G1中的一株双链RNA病毒。获得以下研究结果:1.研究发现,无伤接种条件下,接种后24小时,分生孢子萌发直接形成菌丝从枝条表面的皮孔、裂隙和伤口侵入,未见到附着胞的形成;接种后7天,在侵染点附近的组织内,可观察到少量侵染菌丝,侵染点附近可见细胞木栓化;接种后30天,侵染点附近形成小瘤。有伤接种条件下,接种后24小时,分生孢子萌发直接形成菌丝进入伤口;接种后7天,伤口内有大量菌丝,伤口周围细胞木栓化;接种后20天,侵染点附近形成溃疡病斑。2.葡萄座腔菌基因组大小为45.17Mb,共编码14191个基因,属于6035个基因家族。直系同源基因的系统发育分析显示,葡萄座腔菌基因组与八个代表真菌中的大麦网斑病病原菌(Pyrenophora teres f.teres)同源性最高。致病相关基因分析显示,葡萄座腔菌基因组中有333个碳水化合物活性酶基因、61个次级代谢产物合成相关的骨架基因并分散于59个基因簇中、309个细胞色素P450编码基因、1411个编码转运蛋白的基因、308个候选效应蛋白编码基因及561个病原寄主互作相关基因(PHIgene)。预测发现25个聚酮合酶编码基因(PKS)、17个非核糖体肽合成酶编码基因(NPRS)和1个杂合型PKS-NPRS与已知的毒素或黑色素合成相关基因具有较高的同源性,推测葡萄座腔菌具备合成多种次级代谢产物的能力。与八个参考真菌基因组相比,葡萄座腔菌编码纤维素水解酶的基因数量较少,但编码几丁质酶和果胶酶的基因数量较多。3.在无伤、有伤接种条件下葡萄座腔菌侵染苹果枝条过程关键时间点的转录组分析发现了1156个葡萄座腔菌差异表达基因(DEGs),其中517个基因显著上调。GO富集分析显示,不同接种方法的样本中,葡萄座腔菌基因组中代谢过程(Metabolicprocess)和催化活性(Catalytic activity)功能的基因均发生富集。葡萄座腔菌侵染苹果枝条过程中,预测的次级代谢产物合成相关基因仅少部分高表达,这些高表达基因均匀分布在侵染过程的不同时间点。有伤接种的枝条样本中,葡萄座腔菌编码细胞壁水解酶的基因在接种后24小时出现高表达,而无伤接种的枝条样本中,水解酶编码基因在接种后7天出现高表达。候选效应蛋白编码基因,在无伤接种枝条7天时出现基因高表达,而有伤接种的枝条样本中,高表达基因在不同时间点分布较为均匀,但有伤和无伤接种相同时间点高表达的基因不同。4.对无伤、有伤接种条件下,葡萄座腔菌侵染苹果枝条过程关键时间点的转录组分析发现了苹果的3333个差异表达基因,其中1542个基因显著上调。脱落酸(ABA)信号途径相关基因在接种后24小时表达上调,胼胝质合成相关基因在接种后20天和30天出现高表达。无伤接种样本中,脂肪酸合成和代谢相关基因高表达的时期集中在接种后24小时和7天,而木栓形成相关基因高表达分布在接种后7天、20天和30天。有伤接种样本中,脂肪酸合成和代谢相关基因的高表达集中在接种后24小时,而木栓形成相关基因高表达则集中在接种后20天。5.在葡萄座腔菌低致病力菌株G1中发现了一株Botryosphaeria dothidea chrysovirus 1(BdCV1)的新株系—BdCVS-G1。BdCV1-G1基因组含有四条dsRNA,大小分别为3528、2816、2583 和 2574bp,与 BdCV1 的相似度在 85.29%～90.21%。与 BdCV1 相比,BdCV1-G1 编码的复制酶蛋白缺少了 39个氨基酸,而外壳蛋白(Coatprotein,CP)多20个氨基酸。通过挑取菌丝尖端的方法得到了脱毒菌株,与带毒菌株G1相比,脱毒菌株致病力显著增强、生长速度显著变快、菌落形态变得规则,说明dsRNA病毒BdCV1-G1是使菌株G1生长速度变慢及致病力降低的原因。以上实验结果表明,葡萄座腔菌通过皮孔、裂隙和伤口等孔口侵入枝条,接种后24小时、7天、20天和30天是葡萄座腔菌侵染苹果枝条的关键时间点,受侵染枝条形成的小瘤是寄主抗病、抵御侵染的结果。大小为45.17 Mb的葡萄座腔菌基因组中预测到大量的致病相关基因。侵染过程中,大部分病菌的致病相关基因表达都发生显著变化,有伤和无伤接种条件下,致病相关基因高表达的时间点不同,高表达的基因也有差异。苹果中合成抗病原菌侵染物质相关的基因表达上调,这些基因的表达变化从转录水平解释了,小瘤和溃疡病斑在扩展过程中侵染点周围有木栓化细胞形成。