在农业生产过程中,农药被广泛地用来进行病虫害控制,在一定程度上保障了农业的收成,农药的使用为农业的发展发挥了巨大作用。但是随着农业的发展,农药的使用越来越广泛,再加上不合理利用农药,造成了对环境的污染,给生物的生存带来了威胁,因此,有必要对环境及食用农产品进行农药残留检测。检测农药残留的传统方法主要有气相色谱法、高效液相色谱法等,这些检测方法精确并能够定量,但需要昂贵的设备和受过良好培训的操作人员,不利于大众化,因此,有必要开发一种方便快捷、廉价的农药残留检测方法。乙酰胆碱酯酶(AChE,EC3.1.1.7)是生物神经传导中的一种关键性的酶,在胆碱能突触间,该酶能够水解乙酰胆碱生成胆碱及乙酸,终止神经递质对突触后膜的兴奋作用,保证神经信号在生物体内的正常传递。有机磷农药和氨基甲酸盐农药抑制了昆虫的AChE活性,影响了该酶的正常生理活动,从而使有机体中毒甚至死亡。基于此原理,可以利用AChE来检测农药的存在与否。事实证明AChE可以用来检测农药残留,但要求有纯化的具有相对稳定和高活性的AChE。目前,AChE主要从人或动物的血液中提取,来源有限且成分复杂,影响了检测。有文献报导家蝇的乙酰胆碱酯酶的活性比较高,因此,我们希望通过基因工程手段,人工构建家蝇AChE的表达工程菌株生产重组蛋白,并通过对AChE的三维结构进行分析,为理性改造家蝇AChE提供参考信息。我们利用RT-PCR技术从家蝇中克隆到Ace基因,并构建了Ace基因的pET22b原核表达载体,并将表达载体22b-ace转化表达宿主菌BL21(DE3),通过SDS-PAGE法在69Kd左右的位置检测到了特异的蛋白质条带,结果表明我们获得了家蝇乙酰胆碱酯酶的原核表达。重组蛋白质经QIAexpress Ni-NTA蛋白纯化试剂盒纯化后采用南京建成生物工程有限公司生产的胆碱酯酶检测试剂盒检测,但未发现活性,我们进行了表达条件的优化,如30℃诱导过夜,降低IPTG浓度等,也未能检测到酶活性。AChE是一个糖蛋白,并且存在着多对二硫键,由于大肠杆菌表达系统不存在着翻译后修饰功能,且未能高效地使重组蛋白形成正确的空间折叠,这些可能是造成重组蛋白没有天然活性的主要原因。因此,我们选用具有相对完善的翻译后修饰的酵母菌表达系统,采用酵母表达载体pGAPZαA和pPICZαA,并分别构建了相应的Ace基因表达载体,希望能够获得有活性的重组蛋白。目前已经有文献报导用酵母表达系统可以获得活性重组蛋白,并有越来越多的研究者认为通过对AChE的定点突变有可能较显著地提高酶的活性和稳定性。因此,我们对家蝇的AChE进行同源模建,获得了家蝇的三维结构模型,并从结构水平上分析了一个由G262V突变使家蝇株系获得有机磷农药抗性的可能原因。我们希望通过对家蝇AChE的一系列分析确定对提高酶活性有影响的氨基酸位点,并进行定点突变,如突变活性位点周围的氨基酸使其增加静电