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肌肉的成长发育受到遗传和环境等因素作用。细胞外基质不仅仅为细胞提供着支撑的作用,而且对于细胞的迁移、增殖和分化等生理过程也有着重要的调控作用。近来研究发现,细胞外基质(the extracellular matrix,ECM)中的富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白(the secreted protein acidic and rich in cysteine,SPARC)家族能够调控肌肉的分化,并且SPARC在组织发育以及细胞增殖分化过程中都有着很强的表达。ECM2(the extracelluar matrix 2)是SPARC家族的一员。我们实验室前期通过高通量测序,发现ECM2在分化第三天牛肌肉卫星细胞(muscle-derived satellite cells,MDSCs)中的表达量显著高于其在分化第一天MDSCs中的表达量。因此,本实验以从新生胎牛中分离出来的牛MDSCs为实验材料,探究ECM2基因对牛MDSCs分化的影响。本实验研究了ECM2基因在牛MDSCs分化过程中的表达情况,利用CRISPR-dCase9系统激活和抑制ECM2基因后,探究其对牛MDSCs分化的影响;探究ECM2基因对PI3K信号通路的调控作用。实验结果如下:(1)为了探究ECM2在牛MDSCs分化过程中的表达规律,收集分化第0、1、3、5、7、9天的细胞及培养液中的蛋白样本。通过Western blot和免疫荧光技术,检测牛MDSCs分化过程中细胞内ECM2蛋白的表达变化,结果发现随着牛MDSCs的分化,细胞中ECM2的表达量逐渐上升,并于第5天后表达趋于平稳。同时也检测了分泌到培养液中ECM2的含量,培养液中ECM2的含量也逐渐升高,并在3-5天时达到高峰。(2)利用CRISPR-dCase9系统,分别构建了ECM2基因的三个激活载体和三个抑制载体,将其转染至牛MDSCs后诱导分化48 h,收集细胞中的蛋白质,经过Western blot检测,筛选出激活和抑制效果最好的载体。结果发现,pSPgRNA-N1为最佳的激活载体;pSPgRNA-N2为最佳的抑制载体。(3)为了探究激活ECM2基因对牛MDSCs分化的影响,将筛选好的激活ECM2基因的载体,转染牛MDSCs,后将MDSCs诱导分化,利用免疫荧光染色技术,观察肌管形态以及统计肌管融合率的变化。结果显示,肌管形态变粗变长,肌管融合率显著增加。利用Western blot技术,检测其肌肉分化相关基因MYH3和MYOG的表达情况。结果发现激活ECM2基因后,细胞中的MYH3和MYOG的表达量都显著升高。说明激活ECM2基因能促进牛MDSCs的分化。(4)为了探究抑制ECM2基因的表达对牛MDSCs分化的影响,将筛选好的抑制ECM2基因的载体转染牛MDSCs中,后诱导分化,利用免疫荧光染色技术,观察肌管形态以及统计肌管融合率的变化。结果显示,肌管形态变短,并且肌管融合率显著下降。利用Western blot技术,检测其肌肉分化相关基因MYH3和MYOG的表达情况。结果发现抑制ECM2基因后,细胞中的MYH3和MYOG的表达量显著降低。说明抑制ECM2基因会使牛MDSCs的分化程度降低。(5)为了探究ECM2作用的分子机理,研究了ECM2与PI3K信号通道的关系,通过CRISPR-dCase9系统激活和抑制ECM2基因后,观察PI3K、Akt的蛋白水平及磷酸化水平。结果显示,激活ECM2基因后,PI3K和Akt的磷酸化水平都下降了;抑制ECM2基因,PI3K和Akt的磷酸化水平都升高了。说明ECM2基因能够抑制PI3K信号通路。接下来,为了探究PI3K信号通路对牛MDSCs分化的影响,使用PI3K信号通路抑制剂LY294002抑制PI3K信号通路,观察牛MDSCs分化相关基因MYH3和MYOG的表达情况。结果是MYH3和MYOG的表达量都上升了。上述结果说明,ECM2基因通过抑制PI3K信号通路来促进牛MDSCs的分化。本实验首次证实了ECM2基因对牛MDSCs分化的影响,证明了ECM2基因能够促进牛MDSCs的分化,而且进一步指出了ECM2基因通过抑制PI3K信号通道来促进牛MDSCs的分化。为家畜牛的遗传育种提供理论依据。