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近年来肝脏方面的疾病发病率越来越高,肝炎、肝硬化和肝癌都是常见的肝脏疾病。在中国,最常见的引起肝脏疾病的病因是慢性病毒性肝炎,肝炎长期存在就会损伤肝脏的正常结构而出现肝脏重塑,它包括三个方面:慢性炎症、血管的生成和纤维化反应。肝脏纤维化是一个由多种细胞及大量细胞调节因子参与的病理生理过程,它存在于整个肝脏修复愈合的过程中,其特征是多种炎症细胞和成肌纤维细胞聚集在一起,分泌大量胶原蛋白和多种细胞因子并且刺激细胞的增殖。如果肝脏的损伤因素长期不能去除,肝组织就会出现炎性物质的大量渗出和大片肝细胞的坏死,随之肝脏会变形、变硬,最终形成肝硬化,如果其长期迁延不愈则就会恶变为肝癌。Kruppel样转录因子(Kruppel-like factors,KLF)是一种具有锌指结构的转录因子,其羧基末端的3个C2H2锌指结构是它的特征性标志。KLF家族能参与机体内的细胞增殖、分化及胚胎发育等多个生命活动的调控。其中KLF4是目前研究最广泛的一个KLF家族成员,它能够与其下游靶基因启动子区域内的KLF4结合原件相结合,从而直接调控其下游靶基因的转录水平,所以KLF4是一种重要的转录调节因子。许多研究表明,KLF4还能够通过多种途径抑制成纤维细胞的激活,从而抑制纤维化和肿瘤的发生和发展。血管紧张素Ⅱ1型受体相关蛋白APJ(又名AGTRL1)是在人类基因组中发现的一种孤儿G蛋白偶联受体。其特异性天然配体apelin是一种新型的生物活性肽,血管紧张素Ⅱ的同族体,它可以通过自分泌和细胞内分泌的方式激活其受体APJ并与其结合而发挥病理学和生理学方面的作用。Apelin/APJ系统在心脏、血管、胃肠道、肝脏、肾脏和骨骼肌等多种组织中都有表达,它在炎症和血管生成等方面都发挥重要作用,但是apelin/APJ系统在慢性肝脏疾病的肝脏重塑中的作用仍知之甚少。近期有研究表明在肝硬化的小鼠体内apelin/APJ系统的表达水平比对照组的明显高出很多,而肝硬化病人肝脏内这个系统的表达水平也是非常高的,这就说明apelin/APJ系统的活性和肝硬化存在一定的联系。与肝纤维化和肝硬化的发生和发展密切相关的主要是肝脏中的肝星状细胞(LX-2细胞),在本研究中我们在LX-2细胞中加入肿瘤坏死因子α(Tumor Necrosis Factorα,TNF-α)以后,观察到APJ基因的表达量是减少的,但是其调控机制仍不明确,我们的研究重点就是在LX-2细胞中,TNF-α下调APJ基因的表达是否受核转录因子KLF4的调控。目的:本实验研究的重点是检测LX-2细胞在受到TNF-α刺激以后核转录因子KLF4下调APJ基因表达的分子机制,探索肝纤维化发展过程中新的研究方向。探讨肝星状细胞、TNF-α、APJ基因和核转录因子KLF4在肝脏疾病中的作用和对它的影响。方法:通过基因克隆,重组人PGL3-APJ启动子质粒;提取LX-2细胞中的RNA和蛋白,通过PCR检测TNF-α对APJ和KLF4 mRNA表达水平的影响,并通过Western blot分析检测TNF-α对APJ和KLF4蛋白表达及不同信号通路活化的影响;通过细胞免疫荧光染色检测APJ和KLF4在细胞中的表达量;通过KLF4腺病毒感染LX-2细胞,使细胞中核转录因子KLF4过表达,检测APJ基因mRNA和蛋白的表达情况;通过GKLFsiRNA敲低LX-2细胞中的KLF4基因,使KLF4因子的表达量降低,检测APJ基因mRNA和蛋白的表达情况;通过细胞转染实验和双荧光素酶报告基因检测KLF4对APJ基因启动子转录活性的影响。结果:1、TNF-α可以以时间和浓度依赖方式降低LX-2细胞中APJ基因的转录和翻译水平。TNF-α能够增强核转录因子KLF4的转录和蛋白翻译水平。2、从细胞免疫荧光实验可以观察到TNF-α可以降低APJ在LX-2细胞胞膜和胞浆中的表达,但是能增强KLF4在胞核中的表达。3、在双荧光素酶报告基因的检测中,过表达的KLF4质粒可以显著降低APJ基因启动子的转录活性。4、TNF-α可以减弱LX-2细胞中ERK信号通路的作用,应用磷酸化抑制剂PD98059抑制ERK通路以后,APJ的蛋白表达量是上升的。结论:1、TNF-α可以显著降低LX-2细胞中APJ基因的表达,并增强细胞中核转录因子KLF4的表达。首次证实了KLF4通过与APJ基因启动子上GKLF结合位点的结合,负调控APJ基因启动子的转录活性,从而抑制APJ基因的表达。2、TNF-α可以通过减弱ERK信号通路的作用影响APJ蛋白的稳定性,降低APJ的蛋白表达量。