[研究目的]　　 三叉神经痛是神经病理性痛之一，其疼痛剧烈难忍，易复发，存在扳机点，长期以来被医学界所重视。然而由于其发病机制尚不完全清楚，到目前为止，临床上仍缺乏满意的治疗药物。已有的研究表明神经病理性痛和炎症痛发生时，BKca通道 mRNA和蛋白质在DRG、TG和TNC神经元上表达均显著降低;BKca激动剂 NS1619，可使TNC神经元静息电位超极化，显著地降低了动作电位爆发的频率和幅度，显著逆转L5-L6脊神经结扎所引起的神经病理性痛。而关于三叉神经病理性痛发生时BKca通道的变化，尚未见报道。MAPK家族包括ERK、p38和JNK，在细胞信号转导和基因表达过程中发挥重要的作用，有研究表明神经病理性痛发生时，TG、脊髓背角神经元ERK磷酸化增加，引起痛觉异常，而用拮抗剂抑制ERK磷酸化可以减轻痛觉异常;p38拮抗剂可以阻断TNFα对脊髓背角GABA能神经元自发放电频率的抑制作用，抑制损伤介导的GABA1受体的下调，从而产生镇痛作用;降低JNK1磷酸化，可使炎性因子分泌降低，抑制SNL介导的神经病理性痛。关于在三叉神经病理性发生时MAPK磷酸化调节是否参与其中，并且BKca通道的变化是否受MAPK磷酸化调节尚未见报道，因此本课题运用痛觉行为学、免疫组织化学、分子生物学和全细胞膜片钳记录方法从整体和细胞水平研究BKca通道在三叉神经病理性痛中的变化及其磷酸化调节(p-ERK、p-p38、p-JNK和p-Akt)机制。为进一步阐明三叉神经病理性痛的发病机制提供依据，为寻找新的镇痛靶点和治疗方法打下基础。　　 [研究方法]　　 1．动物分组　　 首先对雄性SD大鼠(200-250g)进行筛选，对面部机械痛阈≥14.9g的大鼠随机分成两组，一组构建三叉神经病理性痛模型（ION-CCI模型），一组进行假手术。　　 2．三叉神经病理性痛模型建造(ION-CCI手术)2％戊巴比妥钠行腹腔注射（50 mg/kg体重）麻醉。沿大鼠右颊部颧骨下缘距鼻背部约0.5 cm，做长约0.5 cm切口，钝性分离，暴露眶下神经。从近端向远端分离约4-5 mm的长度。生物解剖镜下两根铬肠线(4-0)间距约2mm结扎眶下神经，力度适中。压迫标准:镜下可见结扎线使神经的直径略微变细，但不能完全阻断其传导且神经外膜的血液循环必须通畅。假手术组以同样方法暴露眶下神经，但不结扎。　　 3．痛觉行为学测定使用弗莱毛测量术后大鼠面部机械痛阈，从细到粗，每个力度的弗莱毛刺激右侧面部触须垫部位10次，以大鼠有躲闪、逃避、攻击等相关疼痛反应行为记为阳性，10次中有6次或者6次以上记录为阳性时，认为此时弗莱毛相对应的克数即为大鼠面部机械痛阈值。对于ION-CCI大鼠面部机械痛阈≤2g的确定造模成功;比较研究BKca激动剂NS1619、ERK拮抗剂U0126、p38拮抗剂SB203580、JNK拮抗剂SP600125和Akt拮抗剂LY294002分别对假手术和ION-CCI大鼠面部机械痛阈的影响。　　 4．免疫组织化学　　 假手术和ION-CCI大鼠重度麻醉后进行生理盐水灌注，当血液冲洗干净后用300ml4％多聚甲醛灌流，取出TG和TNC，分别放入4％多聚甲醛后固定4h，放入30％蔗糖溶液脱水，待组织块在30％蔗糖溶液中沉入底部后，用O.O1M PBS缓冲液漂洗，制做冰冻切片，室温封闭，抗原暴露，O.O1M PBS缓冲液漂洗3x3min，神经元标记物 NeuN-抗分别和BKca、p-ERK、p-Akt一抗、损伤神经元的标记物ATF3一抗4℃孵育过夜，O.O1M PBS缓冲液漂洗3x3min，在室温条件下分别孵育相应二抗，O.O1M PBS缓冲液漂洗3x3min，封片，荧光显微镜下观察。　　 5．全细胞膜片钳记录假手术和ION-CCI大鼠轻度麻醉后断头处死，急性分离培养大鼠TG神经元，运用全细胞膜片钳分别记录假手术和ION-CCI大鼠TG神经元动作电位和BKca电流，比较假手术组和ION-CCI组TG神经元电特性（动作电位阈电流强度、时程、幅值和后超极化幅值）的改变，BKca电流的变化和ERK拮抗剂U0126、p38拮抗剂SB203580、 JNK拮抗剂SP600125和Akt拮抗剂LY294002分别对BKca电流的影响。　　 6．RT-PCR测定　　 (1) RNA分离和cDNA合成　　 大鼠断头致死后，迅速取出TG和TNC，用Trizol提取液提取总RNA，紫外分光光度计测RNA纯度(A260/280)，同时行RNA定量。提取的RNA中，每样本取2μl在20μl体系中反转录成cDNA，-20℃保存，用于实时定量聚合酶链式反应扩增 BKca通道基因。　　 (2) RT-PCR　　 用于扩增BKca通道α基因的引物对为:AGGAATGCATCTTGGCGTCACTC（正义），CCTCGAAGTGCATTCTCCTCAGC（反义）;反应条件为:94℃，Smin;94℃，35s;58℃，90s;72℃，90s。用于扩增BKca通道pi基因的引物对为: ATGGAGGCTCAACCCAGATGG（正义）,CCCATCTGCCCACAGCTGATA（反义），p2基因的引物对为:ACTGCTGCGCTCGTACATGCA（正义）， CGTTGGCCAGAAGAGAGAATGGA（反义）; p3基因的引物对为 GGCTGTAGAACCACCCAAGTC（正义），TCTTCTCTGGGAGAGCTGAC（反义）; p4基因的引物对为CGAAGCTCAGGGTGTCTTACG（正义）， CAGTGCAGGAGGACAATCTCG（反义），pi、2、3、4基因反应条件均同α基因;β-actin基因的引物对为ATGGTGGGTATGGGTCAGAAG（正义）， TGGCTGGGGTGTTGAAGGTC（反义），反应条件为:95℃，2min;95℃，20s;58℃，25s;72℃，25s。　　 7．Western blot　　 大鼠轻度麻醉后断头致死，迅速取出TG和TNC，用RIPA蛋白裂解液迅速裂解蛋白，匀浆，BSA法紫外分光光度计(wave595)测蛋白浓度，同时行蛋白定量。提取的样本中，每次取60μg蛋白上样电泳，恒压120V电泳90min，随后恒流300mA转膜120min，脱脂牛奶封闭，洗膜，BKca、p-ERK、p-Akt-抗孵育4℃过夜，隔天洗膜，常温孵育BKca、p-ERK、p-Akt=抗60min，显影拍照，测量灰度并统计分析。　　 [结果]　　 1．痛觉行为学测定，与假手术大鼠相比，ION-CCI大鼠面部机械痛阈显著下降。运用眶下孔注射方法，对术后第15天的ION-CCI组大鼠，注射BKca通道激动剂NS1619 IOOμg/lOOμl，可以显著增加ION-CCI大鼠面部痛阈，起到镇痛效应。　　 2．免疫组织化学方法，研究表明ION-CCI大鼠与假手术大鼠相比TG和TNC神经元ATF3的表达显著增加、BKca表达明显下降，其中直径30-40μm TG神经元上BKca的表达显著降低，p-ERK在TG神经元上表达显著增加，而p-Akt表达无明显的变化。　　 3．分别取术后第15天ION-CCI和Sham组大鼠TG和TNC，RT-PCR结果显示，BKca通道的组成性α亚基以及调节性的β2、β4亚基大量表达，而调节性的βl、β3亚基不表达。ION-CCI术后大鼠TG和TNC上BKca通道的α、β2、β4亚基在mRNA水平表达较Sham组均显著下降，Western blot结果提示，ION-CCI术后大鼠TG和TNC上的BKca通道蛋白表达含量较Sham组显著下降，p-ERK在TG上表达显著增加，p-Akt表达没有明显改变。　　 4．利用全细胞膜片钳记录神经元动作电位阈电流强度、幅值、时程和快速后超极化的幅值，与假手术组相比，ION-CCI组大鼠TG神经元动作电位阈电流显著下降，动作电位的幅值、时程没有明显的变化，快速后超极化的幅值显著降低。　　 5．利用全细胞膜片钳记录假手术和ION-CCI大鼠TG神经元BKca电流，与假手术组相比，ION-CCI组BKca电流显著降低，对Paxilline敏感的BKca电流显著降低，对Paxilline不敏感的BKca电流没有明显的影响。　　 6．痛觉行为学测定，与假手术大鼠相比，ERK拮抗剂U0126 lOμg/20μl、p38拮抗剂SB203580 lOμg/20μl、JNK拮抗剂SP6001251Oμg/20μl和Akt拮抗剂LY294002IOOμg/20μl都可以显著提高ION-CCI大鼠面部痛阈，起到镇痛效应。　　 7．全细胞膜片钳记录ERK拮抗剂U0126、p38拮抗剂SB203580、JNK拮抗剂SP600125和Akt拮抗剂LY294002分别对BKca电流的影响。结果显示，ERK拮抗剂U0126 lμM、p38拮抗剂SB203580 lOpM和30μM均可以显著增大ION-CCI组大鼠TG神经元BKca电流，而Akt拮抗剂LY294002、JNK拮抗剂SP600125 lOμM和100μM对ION-CCI组大鼠TG神经元BKca电流没有明显的影响。　　 [结论]　　 1．ION-CCI大鼠TG和TNC BKca表达降低、面部机械痛阈显著降低，BKca激动剂NS1619可以显著提高ION-CCI大鼠面部机械痛阈，起到镇痛效应。　　 2．ERK拮抗剂U0126和p38拮抗剂SB203580均可显著增大TG神经元BKca电流，提高ION-CCI组大鼠面部机械痛阈，起到镇痛效应。　　 TG和TNC神经元BKca表达显著降低，神经元兴奋性增高，参与了眶下神经慢性缩窄环术(ION-CCI)大鼠面部痛觉过敏和痛觉异常。这一过程可能与增强ERK及p38 MAPK的磷酸化从而对BKca通道的抑制性调节有关。