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研究目的：构建并筛选可表达mTOR基因特异性siRNA的慢病毒，并在此基础上采用巨噬细胞特异性启动子联合重组酶表达基因构建可在巨噬细胞内特异表达siRNA的慢病毒表达载体，为后续体内外研究其抗Mtb感染的效果及机制奠定基础。研究方法：1.根据mTOR基因的mRNA序列选择3条靶序列，根据每条靶序列按siRNA设计原则设计相应的shRNA，同时根据其中一条shRNA序列设计一条长度及碱基组成与之完全一致，但碱基顺序被随机打乱的序列作为对照shRNA序列。针对每条shRNA各设计一对单链寡聚脱氧核苷酸，经缓慢退火后形成可表达相应shRNA的双链DNA，通过限制性内切酶HpaⅠ和XhoⅠ克隆入慢病毒表达框架质粒pSicoR中，获取pSicoR-mTOR干扰质粒并命名为pSM系列载体。转化大肠杆菌DH5α后，筛选阳性克隆、提取质粒，经酶切鉴定正确后进行DNA测序。2.将重组慢病毒表达载体（pSM系列质粒）、慢病毒包装质粒psPAX2、包膜蛋白质粒pMD2.G按照一定比例混合共转染293T细胞，收集含有慢病毒颗粒的上清液，超滤离心，浓缩病毒颗粒。将慢病毒颗粒感染293T细胞，利用逐孔稀释法在倒置荧光显微镜下检测荧光表达情况，并计算病毒的滴度。采用适当滴度的慢病毒颗粒感染小鼠巨噬细胞RAW264.7，48h后，观察慢病毒颗粒感染RAW264.7细胞的情况。采用实时荧光定量PCR和Western blot检测巨噬细胞内mTOR基因表达的变化。3.利用PCR技术从质粒Cre-Amp中扩增出重组酶表达基因Cre，克隆至质粒pBudCE4.1-SP146的Hind III/Xba I位点中，获得重组质粒pBudCE4.1-SP146-Cre，酶切鉴定正确后送测序。4.采用PCR技术分别扩增获取SP146-Cre片段、pSico的0至3808片段以及pSico的3783至7566片段，然后利用In-Fusion克隆技术将SP146-Cre克隆1国家自然科学基金资助项目（编号：30901284）至pSico中。将重组载体pSico-SP146-Cre转化大肠杆菌后选取阳性克隆菌，采用菌落PCR方法进行重组质粒鉴定，鉴定成功后送测序验证。5.将SP146启动子调控的质粒pSico-SP146-Cre分别转染293T、RAW264.7细胞，通过SP146启动子调控Cre/LoxP系统情况下，通过绿色荧光的表达模式观察评价巨噬细胞特异性启动子的特异性以及SP146调控下的Cre/LoxP系统的功能。研究结果：1.酶切及测序的结果显示，mTor特异性siRNA表达序列及对照序列均正确插入到质粒pSicoR中，成功构建了mTOR基因特异性的siRNA慢病毒表达载体pSM1, pSM2, pSM3及对照siRNA表达载体pSM4。2.利用293T细胞包装重组慢病毒表达载体pSM1/2/3/4，生产出慢病毒颗粒后进行病毒浓缩，经病毒滴度测定，四组慢病毒lenti-pSM1/2/3/4的滴度分别是6×106TU/ml、1×106TU/ml、4×106TU/ml、2.5×106TU/ml。四种重组慢病毒颗粒感染RAW264.7细胞，48h后均可观察到明亮的绿色荧光，表明重组慢病毒能有效感染RAW264.7细胞。3.实时荧光定量PCR及Western blot检测的结果相一致，均证实了lenti-pSM1组、lenti-pSM2组、lenti-pSM3组的mTOR mRNA及蛋白表达均受到抑制，其mTOR mRNA表达水平的抑制率分别是24.1%、59.3%、41.1%，蛋白表达水平与空白对照组（0.9567±0.021）及lenti-pSM4组（0.9200±0.030）相比三实验组的灰度值分别为：0.9033±0.025、0.883±0.031、0.893±0.032，其中lenti-pSM2组为最佳干扰效果组。4.菌落PCR及测序结果证实，MФ特异性启动子序列SP146及Cre基因片段已成功插入质粒pSico中，成功构建了慢病毒表达载体pSico-SP146-Cre。将该重组载体及转染入293T及RAW264.7细胞，观察到其在293T细胞中有很强的绿色荧光，但是在RAW264.7细胞中几乎没有绿色荧光。结论：1.成功构建了针对mTOR基因干扰序列的系列慢病毒表达载体pSM。2.完成了慢病毒的包装和浓缩，成功地利用构建的重组慢病毒载体生产的慢病毒颗粒感染了RAW264.7细胞，并筛选出mTOR shRNA2为最有效的干扰序列。3.成功构建了携带MФ特异性启动子序列SP146、重组酶Cre基因的慢病毒表达载体pSico-SP146-Cre。4. SP146启动子具有良好的MФ特异性，可调控Cre/LoxP系统，为后续动物水平的实验研究奠定基础。