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‘琯溪蜜柚’（Citrus maxima‘Guanximiyou’）是中国柚类果树栽培面积最大的品种,福建是‘琯溪蜜柚’的主产区,其产量约占全国柚类总产量的2/3、世界柚类总产量的1/3。‘琯溪蜜柚’成熟期为每年的10–12月,上市的时间过于集中,导致我国柚类货架空窗期长,因此培育不同成熟期的蜜柚品种是满足我国柚类市场需求的关键。近年,在福建平和发现了一株‘琯溪蜜柚’早熟芽变,经连续多年观察,发现其早熟性状稳定,因其在农历六月份成熟,故命名为‘六月早柚’。目前,蜜柚果实成熟机制并不清楚,因此研究蜜柚果实成熟机制具有重要理论和应用意义。故本研究以‘琯溪蜜柚’（WT）及其早熟芽变品种‘六月早柚’（MT）为研究材料,采用多组学手段（全基因组重测序、转录组、全基因组DNA甲基化组等）研究了它们在果实成熟过程中的差异,并对候选基因进行了功能验证。主要研究结果如下:1.WT和MT的SSR标记开发基于高通量测序数据筛选并鉴定了用于WT及MT早期筛选的SSR分子标记。首先对2个品种进行了转录组测序和全基因组重测序,然后进行了转录组与质体基因组的组装和SSR的识别,共筛选出了41个具有多态性的SSR,经聚丙烯酰胺凝胶电泳验证,最终获得了4对可用于早熟柚品种筛选的SSR引物。2.WT和MT遗传差异分析将WT与MT全基因组重测序数据与柚参考基因组进行比对,通过全基因组变异分析,发现大量的SNP和In Del,对这些变异的基因进行了GO、COG和KEGG富集分析,鉴定获得脱落酸（ABA）、生长素（IAA）和乙烯（C2H4）代谢及信号转导途径相关的48个变异基因,说明内源激素代谢在蜜柚早熟突变性状形成过程中扮演重要角色。3.WT和MT果实成熟过程内源激素及品质差异比较采集幼果期到商业成熟期WT（S1–S9）和MT（S1–S7,其中S6为商业成熟期,S7为完全成熟时期）果实,测定所有时期的内源激素、可溶性糖和有机酸含量以及果皮厚度。结果显示:2个品种果实中的ABA含量表现出完全不同的代谢规律,MT呈单峰型,在S4时期达到最大值,远高于WT所有时期;MT的果皮厚度从S4时期开始小于WT,说明ABA可能是促进MT果实早熟的关键因子,且S4时期是2个品种成熟差异的转折点。此外,MT果实柠檬酸代谢方式发生了改变,不同于WT和传统柑橘果实先升后降趋势,而是逐渐积累到成熟期,这种改变可能是MT果实成熟时间缩短的重要原因。4.WT和MT果实成熟过程转录组差异为全面了解WT和MT在转录水平上的动态差异,采用RNA-seq技术比较了2个品种S1–S6阶段果肉（MT从幼果到商业成熟阶段）转录组差异。共筛选到了2099个差异表达基因（DEGs）,6个时期分别有212、407、259、893、887和503个差异基因,S4时期是DEG数量最多,与生理数据一致。KEGG代谢通路富集分析结果显示:这些DEGs分布在33条不同的代谢通路,其中ABA、IAA、BR以及激素信号转导途径富集到了大量的DEGs,另外淀粉和蔗糖、糖酵解、苯丙烷等与成熟相关的通路上也存在许多DEGs,说明2个品种转录水平差异明显,而且S4–S6时期是MT进入快速成熟的阶段。5.差异基因的表达模式及候选基因筛选通过转录组和生理数据关联分析,发现两个品种ABA、IAA、糖酸代谢以及细胞软化途径差异显著,对这些路径的DEGs表达模式进行了分析,发现2个品种ABA含量的显著差异可能主要受降解途径基因CgCYP707A4的调控,其在MT中低表达,而在WT中高表达;另外,通过分析柠檬酸代谢通路DEGs,发现柠檬酸合成酶基因CgCS1与柠檬酸含量变化结果一致,说明其可能是MT和WT柠檬酸代谢差异的关键因子;18个果实软化相关差异基因中有11个促进果实软化的基因在MT中转录水平高于WT（4个PGs、3个XTHs、1个PME、3个PLs）,2个抑制果实软化基因（Cg PMEi2、Cg PMEi3）转录水平低于WT,说明MT早熟与果肉软化速度快有关。6.CgCS1基因的功能验证从MT中克隆得到CgCS1基因序列,构建重组质粒p GWB502-CgCS1,并将其转化到‘沙田柚’中,以探究其生物学功能,最终获得了2株转基因植株（OE-176和OE-141）。q RT-PCR试验结果显示,OE-176中CgCS1转录水平约为对照的15倍、OE-141约为对照的3倍;同时,对转基因植株和对照的叶片进行了有机酸含量测定,发现OE-176和OE-141柠檬酸含量均高于对照,且OE-176最高,说明CgCS1能够调控‘沙田柚’叶片柠檬酸合成,可能是影响MT柠檬酸代谢模式改变的关键基因。后续研究中可通过检测转基因植株果实柠檬酸含量进一步揭示该基因的作用。7.CgCYP707A4基因的功能验证建立了草莓瞬时表达体系,并获得超表达CgCYP707A4基因的草莓,发现该基因的过表达降低了草莓果实的ABA含量,延迟了草莓的转色,说明CgCYP707A4负调控果实的成熟。进一步利用VIGS沉默了辣椒中的CgCYP707A4同源基因Ca CYP707A1,发现Ca NCED1和Ca NCED3均下调表达,说明Ca CYP707A被沉默后,ABA降解减慢故含量高,因此ABA合成基因Ca NCED1、Ca NCED3通过下调表达以维持ABA在辣椒中的含量;而ABA受体基因Ca PYLs中有9个是下调表达,仅Ca PYL7极显著上调表达,说明了当ABA含量增加的时候,Ca PYL7是响应ABA信号的主要受体基因。8.DNA低甲基化与蜜柚果实成熟的关系DNA甲基化被认为是继内源激素和转录因子之后又一个调控果实成熟的重要因子,通过对S3–S6时期MT与WT果实全基因组DNA甲基化测序与分析,发现MT与WT相比,CG、CHG和CHH三种类型的hypo-DMR数量均低于hyper-DMR,且这种变化是由于CHH决定的;进一步利用甲基化抑制剂（5-Azacytidine）处理了蜜柚果实幼果,发现只需4天果皮即可转色,由此推测,DNA低甲基化可能与蜜柚果实的成熟正相关。生理数据分析结果显示果皮转色是由于叶绿素大量降解和类胡萝卜素少量下降引起的。为了进一步探究DNA去甲基化对果皮转色的分子调控机制,对MT处理组和对照组进行了转录组分析,发现叶绿素下降是由于叶绿素合成途径基因（POR、CAO）下调表达且降解途径基因（CLHs、RCCR）上调表达的共同作用,从而促进了叶绿素a和叶绿素b的降解;与此同时,类胡萝卜素代谢基因（ZDS、Ctr Z等）下调表达,促进了相应类胡萝卜素含量的下降,进而导致类胡萝卜素含量下降。