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低温是一种严重影响玉米生长发育、产量、品质、播种区域以及播种时间的环境胁迫。低温冷害导致玉米生长发育迟缓、植株畸形和产量降低,低温冻害则直接导致植株的死亡。为了更好的利用早春、高纬度和高海拔光热资源,人们对耐低温、抗冻的玉米品种的需求迫切。虽然到目前为止很多关于玉米耐冷的候选基因报道,但未曾见到将其用于品种选育,仅限于理论研究方面。矮沙冬青抗冻蛋白（AnAFP）是一种功能性蛋白质,在植物受到冰冻胁迫时,抗冻蛋白通过降低胞液的冰点和抑制细胞液中的小冰晶生长,防止细胞因胞内结冰而导致的细胞死亡。脱水蛋白是胚胎发育晚期丰富蛋白二家族成员,通过保护酶活、降低膜相变温度、结合重金属离子以及替代水分子来减轻细胞在低温、脱水等逆境的伤害。在本课题组的前期研究中我们将矮沙冬青抗冻蛋白基因AnAFP转入原核细胞以及烟草中均提高了抗冻能力,并将其通过农杆菌浸染法转入我国西南优良玉米自交系18-599红中,并获得了转AnAFP基因玉米。本文以转AnAFP基因玉米的T1代和矮沙冬青为基本材料进行后续研究,其主要结果如下:1.通过TAIL-PCR在T1代转基因玉米中鉴定了3个整合在玉米1号染色体上位点,解释了外源基因未分离的原因;使用了一种新方法在T1代找到了整合位点1和位点2的纯合株系以及在T2代找到了位点3的纯合株系;通过对纯合株系的全长插入T-DNA和串联模式鉴定发现株系1和株系2均为头尾串联双拷贝,株系3为单拷贝。2.外源基因在mRNA水平和蛋白水平上均在三个转基因株系中异源表达,但株系1和株系3的表达量均高于株系2;株系3的T-DNA整合造成了其插入位点附近基因表达量的增加,而株系1和株系2的T-DNA整合对其附近基因的表达未产生影响;RNAseq测序发现在正常生长条件下和4℃处理24h 3个株系和未转基因对照间有4个共有的差异基因且均为下调。3.4-8℃低温胁迫处理5天组织化学染色和相对离子渗透率测定均发现转基因株系1和2抗冷性明显提高;在室内盆栽试验-2℃处理5 h株系1和株系2的存活率极显著的高于未转基因株系;2018年田间试验转基因玉米在长期低温寡照和短暂冷冻胁迫下转基因玉米存活率、地上干物质积累量以及长势均优于未转基因对照。4.对矮沙冬青抗冻蛋白基因启动子分析发现其存在多个非生物胁迫诱导的顺式作用元件;进化关系树分析发现矮沙冬青抗冻蛋白AnAFP属于KnS型脱水蛋白,同源比对分析发现存在脱水蛋白的K结构域、NLS结构域和S结构域;磷酸化预测分析发现AnAFP的S结构域存在多个可以被CKⅡ激酶磷酸化的磷酸化位点。5.克隆矮沙冬青AnICE1和AnCBF基因,同源比对发现AnICE1基因存在保守的HLH结构域和ACTUURACRLIKE结构域,AnCBF基因存在保守的AP2结构域;矮沙冬青幼苗在冷、ABA以及脱水胁迫条件下,对AnAFP、AnICE1和AnCBF基因qRT-PCR分析发现这三个基因具有相同的变化趋势;酵母单杂交结果显示AnCBF基因在酵母中可以结合AnAFP基因启动子中的DRE顺式作用元件来启动下游报告基因的表达。6.使用重叠PCR对AnAFP基因进行结构域缺失突变;对结构域突变基因进行原核表达和纯化;体外磷酸化显示S结构域可被CKⅡ蛋白激酶磷酸化,且该磷酸化可以被TBB所抑制;纯化的结构域突变蛋白可以3倍以上的提高乳酸脱氢酶活性,且该活性提高与结构域无关。7.克隆玉米中CKⅡ蛋白激酶的β亚基,亚细胞定位发现β2、3、4亚基主要定位在细胞核中但细胞质中也有少量存在,而β1亚基仅定位在细胞核中;双分子荧光互补实验发现β1、3、4可以与AnAFP基因相互作用,而这种相互作用在酵母双杂交实验中并未得到验证,我们推测AnAFP和CKⅡβ亚基的相互作用需要全酶的参与。对AnAFP进行亚细胞定位发现在正常生长的细胞中AnAFP处于磷酸化和非磷酸化的混合状态而定位在细胞核和细胞质中,加入CKⅡ磷酸激酶抑制剂时AnAFP仅定位在细胞核中,低温胁迫下仅存在于细胞质中,即AnAFP通过CKⅡ对其的磷酸化作用由细胞核转移至细胞质中发挥功能。在本文的研究中我们使用了一种能够在转基因植物T1代鉴定转基因纯合株系的方法,根据其原理该方法将适用于任何二倍体转基因植物。同时发现矮沙冬青抗冻蛋白（AnAFP）是一种具有抗冻功能的KnS型脱水蛋白。植物在正常生长情况下AnAFP处于磷酸化和非磷酸化的混合状态而定位于细胞质和细胞核中,在低温胁迫下CKⅡ进一步对AnAFP进行磷酸化而导致其向细胞质中转运。细胞质中的抗冻蛋白通过提高胞液中酶的活性和提高细胞膜的稳定性来提高转基因玉米的耐冷性。在冰冻胁迫下抗冻蛋白通过降低胞液的冰点和抑制小冰晶的聚合来提高转基因玉米的抗冻性。盆栽和田间试验表明转基因株系1和株系2在长期低温寡照和短暂冰冻胁迫下转基因株系显著优于未转基因对照。鉴于低温冷害和低温冻害对玉米造成的严重影响,我们研究的AnAFP的抗冻和耐冷机理将会为对人们进行耐冷玉米研究提供理论指导,同时我们研究的转AnAFP玉米将为常规育种提供耐冷玉米资源。