论文部分内容阅读
目的：1.维持斑马鱼模式集中养殖与繁育系统稳定运行，为实验开展提供优质胚胎、幼鱼和成鱼。2.整体水平上探讨秋水仙碱对斑马鱼幼鱼体内SOD、Na+-K+-ATPase活性和MDA、GSH含量的影响3.观察秋水仙碱对斑马鱼幼鱼体内抗氧化酶表达相关基因bcl2、gstp2、ucp2、nqo1、sod1的表达情况。4.局部水平上研究秋水仙碱对斑马鱼幼鱼体内肝脏Shh、Gli3蛋白表达以及肝脏脂肪含量的影响。方法：1.在斑马鱼模式生物集中繁育系统稳定运行基础上，获取胚胎，培育幼鱼和成鱼用于实验。2.药物暴露实验按如下方法进行：预实验基础上确定幼鱼药物暴露72h最大不致死浓度（MNLC），将3dpf斑马鱼幼鱼随机分为五组，给药浓度分别为0.2MNLC、0.5MNLC、1.0MNLC、LC10，以Holt Buffer为空白对照组，药物作用72h，进行各项指标测定：（1）抗氧化酶活性及抗氧化物含量测定。将幼鱼充分研磨，制成组织匀浆，离心，取上清，测定幼鱼体内超氧化物歧化酶（SOD）、钠-钾-三磷酸腺苷酶（Na+-K+-ATPase）活性和谷胱甘肽（GSH）、丙二醛（MDA）含量。（2）抗氧化酶相关基因表达情况。利用RT-PCR方法测定药物作用72h后斑马鱼幼鱼体内抗氧化酶表达相关基因bcl2、gstp2、ucp2、nqo1、sod1的表达情况。（3）肝组织病理变化以及Shh、Gli3蛋白表达情况测定。4%多聚甲醛磷酸液4℃固定24h，脱水，石蜡包埋，切片，对斑马鱼幼鱼进行HE染色、油红染色，并采用免疫组化方法分析斑马鱼幼鱼体内Shh、Gli3蛋白表达变化情况。结果：1.斑马鱼模式生物集中繁育体系能够为实验开展提供优质胚胎，繁育幼鱼和成鱼用于实验。2.秋水仙碱对6dpf斑马鱼幼鱼的MNLC为20.6063μg mL-1，LC10为26.0615μg mL-1，LC50为34.7536μg mL-1。与空白对照组相比，随着秋水仙碱浓度增大，斑马鱼幼鱼SOD和Na+-K+-ATPase活性均降低；MDA含量随着浓度增大而升高；GSH含量随着浓度增大，含量降低。3.与空白对照组相比，随着秋水仙碱浓度增加，各给药组bcl2-mRNA、gstp2-mRNA、nqo1-mRNA、sod1-mRNA表达量减少。而ucp2-mRNA表达量与对照组相比则呈上升趋势。4.与空白对照组比较，随着秋水仙碱浓度增加，HE染色结果显示，高剂量组的幼鱼肝组织变性，空泡增多，细胞间距增加。油红染色结果显示斑马鱼肝脏颜色加深，提示肝脏中脂肪含量增加；免疫组化法测定斑马鱼肝脏中Shh、Gli3蛋白表达量，随着药物浓度增加，两种蛋白含量表达增加，提示秋水仙碱对肝脏损伤作用可能跟激活Hedgehog信号通路上相关成分有关。结论：1.斑马鱼模式生物集中繁育体系稳定运行，可为药物安全性评价提供胚胎、幼鱼、成鱼三种时期的实验对象，扩大了应用斑马鱼进行药物安全性评价的应用范围。2.以斑马鱼幼鱼为实验对象，研究秋水仙碱对斑马鱼抗氧化系统的影响，表现为SOD和Na+-K+-ATPase活性受到抑制，GSH含量降低，MDA含量显著增加，导致幼鱼体内氧化还原状态失调。秋水仙碱对斑马鱼幼鱼毒性作用可能与此相关。秋水仙碱对斑马鱼幼鱼肝脏毒性的机制可能与激活Hedgehog信号通路有关。