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Corynebacterium glutamicum LD320是一株L-异亮氨酸高产菌株。该菌通过多轮传统诱变筛选获得,很难再进一步通过诱变提高其L-异亮氨酸产量。本文针对L-异亮氨酸生产菌Corynebacterium glutamicum LD320,结合代谢组学、蛋白组学等技术对L-异亮氨酸合成途径、分泌系统及其调节机制进行了研究,并进一步提高了C.glutamicum LD320的L-异亮氨酸的产量。主要结论如下:(1)通过在C.glutamicum LD320中过表达L-异亮氨酸合成途径中野生型和突变型的关键酶比较发现,表达突变型酶的产酸水平优于表达野生型酶,其中突变型的TD1和AHAS1能够显著提高谷氨酸棒杆菌中L-异亮氨酸的产量。(2)对TD和AHAS酶学性质研究发现,突变型TD1能够完全耐受高浓度的L-异亮氨酸的反馈抑制,还能被低浓度的L-异亮氨酸激活;突变型AHAS1能部分耐受单个或组合支链氨基酸的反馈抑制。同时,突变型TD1和AHAS1的共表达菌株LD320/pXMJ19-ilvBN1-ilvA1的L-异亮氨酸摇瓶产量达到4.55 g/L,产量较出发菌株提高了29%。(3)在C.glutamicum LD320中过表达突变型brnFE1基因能有效加强L-异亮氨酸的外排能力,LD320/pXMJ19-brnFE1的L-异亮氨酸摇瓶产量可达到4.44 g/L,较出发菌株提高了21%。(4)突变型基因ilvBN1、ilvA1和brnFE1共表达能显著提高L-异亮氨酸产量,LD320/pXMJ19-ilvBN1-ilvA1-brnFE1的L-异亮氨酸摇瓶产量达到5.17 g/L,产量较出发菌株提高了41.3%。(5)基于摇瓶水平对培养基进行了优化。结果表明:生物素biotin的最适浓度为0.5 mg/L,最适前体物苏氨酸的最适浓度为1 g/L的,最适表面活性剂Tween-80的添加时间和添加浓度分别是16 h和0.5 g/L。(6)综合所有优化条件,在7 L发酵罐上进行了放大实验,在发酵65 h后,LD320/pXMJ19-ilvBN1-ilvA1-brnFE1的L-异亮氨酸产量由18.53 g/L到25.45 g/L,相比对照组提高了37%。