背景：起源于胆囊上皮的胆囊癌(Gallbladder cancer, GBC)是胆道系统中常见的恶性肿瘤,大部分胆囊癌患者在确诊后一年内死亡当前,手术切除是治疗胆囊癌最好的选择,但多数患者确诊时己处于中、晚期,手术切除率低,仅有5.2%-22%的病人有条件实施根治性手术,这也是其整体生存率低的原因。临床上胆囊癌发病隐匿,具有进展迅速、切除率较低的特点,其临床表现常缺乏特异性,如腹痛、恶心、黄疸、食欲减退、体重下降等。目前尚无特异实验室检查或标记物用于辅助诊断,因此近20%可切除患者均是在偶然情况下确诊。流行病学调查显示,胆囊癌的发病率呈逐年上升趋势。癌症是一种由遗传学和表观遗传学水平上的异常改变而导致的多因素恶性疾病。近年来,大量研究倾向于支持癌症发生可能源于极少数具有干细胞特性的肿瘤细胞——肿瘤干细胞(Cancer stem cells, CSCs),一类具有干细胞自我更新与分化能力的肿瘤细胞亚群。传统癌症治疗手段,包括手术、放(化)疗等,尽管有一定疗效,但极易转移和复发。究其原因,肿瘤干细胞假说认为肿瘤的复发和转移,源自存在于肿瘤中为数较少的肿瘤干细胞,其具备高度增殖、自我更新及多向分化潜能,是肿瘤再生的“马达”,而传统的治疗方法并不能靶向杀伤肿瘤干细胞,因而只要存在肿瘤干细胞,肿瘤就不可能被治愈。因此,癌症根治的关键和难点是杀伤肿瘤干细胞,而针对肿瘤干细胞发生机制的基础研究则有望阐释这一难题并提出相对应治疗策略。DNA芯片(DNA microarray)技术可在同一时间定量检测大量基因的表达,是重要的基因组学和遗传学研究的工具。本课题从比较胆囊癌GBC-SD细胞与正常胆囊细胞的基因差异表达着手,应用DNA芯片对正常胆囊/胆囊癌细胞株DNA筛选与胆囊癌中肿瘤干细胞相关性基因,通过检测其在胆囊良恶性组织中的表达状况及其与胆囊腺癌临床预后的关系,并通过RNAi技术及体外实验研究胆囊癌中肿瘤干细胞相关性基因对胆囊癌细胞生物学功能的影响,从而初步探讨胆囊癌中与肿瘤干细胞有关的分子机制,旨在为胆囊癌的早期诊断、靶向治疗提供新思路。基于此,本课题的研究内容包括以下四部分：第一部分正常胆囊细胞与胆囊癌细胞差异表达基因分析目的应用DNA芯片技术比较胆囊癌GBC-SD细胞和正常胆囊细胞的基因表达,获得胆囊癌与正常胆囊上皮细胞的差异基因表达谱,为筛选胆囊癌中肿瘤干细胞相关基因提供依据。方法培养胆囊癌GBC-SD细胞及正常胆囊细胞,提取两组细胞的总RNA,质检合格后进行荧光标记,在含有21522个Oligo DNA的晶芯(?)基因组寡核苷酸芯片上杂交,激光扫描仪扫描后根据根据荧光强度筛选出差异基因,实验结果作生物信息学分析。结果共筛选出2288个胆囊癌正常胆囊细胞间差异表达的基因。其中814个基因在胆囊癌细胞中表达上调,1474个基因表达下调,基因功能分析涉及细胞周期、细胞增殖、肌动蛋白调节、细胞凋亡等；信号通路(Pathway)分析涉及到MAPK信号通路、Wnt信号通路、TGF-β信号通路、VEGF信号通路、T细胞受体信号通路、ErbB信号通路、Jak-STAT信号通路等。结论对胆囊癌GBC-SD细胞及正常胆囊上皮细胞之间基因表达谱的比较分析,发现了许多涉及多种功能蛋白和信号通路的肿瘤相关差异表达基因,结合文献分析认为ALDH1A3及GPX3为具有重要意义的肿瘤干细胞相关基因,将作为我们进一步研究的对象。第二部分ALDH1A3、GPX3mRNA及蛋白在胆囊腺癌及慢性胆囊炎组织中的表达目的通过检测胆囊腺癌和慢性胆囊炎组织中ALDH1A3及GPX3mRNA与蛋白质的表达水平,对第一部分DNA芯片的结果进行验证,并探讨它们在胆囊癌发生、发展中的作用。方法收集胆囊腺癌及慢性胆囊炎新鲜组织标本各15例,提取组织的总RNA及总蛋白,RT-PCR检测ALDH1A3及GPX3mRNA; Western-blot检测ALDH1A3及GPX3蛋白,实验结果进行统计分析。结果1ALDH1A3mRNA在慢性胆囊炎组织中的表达低于胆囊腺癌组织,两者比较有显著统计学差异(0.312±0.019vs1.255±0.042,P<0.01); GPX3mRNA在慢性胆囊炎组织中的表达高于胆囊腺癌组织,两者比较有显著统计学差异(1.187±0.013vs0.107±0.015, P<0.01)。2ALDH1A3蛋白在慢性胆囊炎组织中的表达低于胆囊腺癌组织,两者比较有显著统计学差异(0.711±0.022vs2.121±0.226,P<0.01)；GPX3蛋白在慢性胆囊炎组织中的表达明显高于胆囊腺癌组织,两者比较有显著统计学差异(2.209±0.131vs0.385±0.025,P<0.01)。结论与慢性胆囊炎组织相比,胆囊腺癌组织中ALDH1A3mRNA及蛋白均为高表达而GPX3mRNA及蛋白均为低表达,这与第一部分DNA芯片的结果相一致,ALDH1A3、GPX3基因可能是重要的胆囊癌中肿瘤干细胞相关基因。第三部分ALDH1A3和GPX3在胆囊良恶性病变组织中的表达及临床病理意义目的检测胆囊良恶性病变组织中ALDH1A3和GPX3表达水平并探讨其在胆囊腺癌中的临床病理意义,揭示其与胆囊腺癌发生发展及预后的相关性。方法收集100例人胆囊腺癌、46例胆囊腺癌癌旁组织、30例胆囊腺瘤、15例胆囊腺瘤性息肉和35例慢性胆囊炎组织,对标本作常规石蜡包埋切片,EnVisionTM免疫组化检测ALDH1A3、GPX3的表达。结果(1)100例人胆囊腺癌组织中ALDH1A3阳性表达为45例(45%),46例癌旁组织阳性表达为8例(17.4%),30例腺瘤阳性表达为3例(10.0%),15例腺瘤性息肉阳性表达为1例(6.7%),35例慢性胆囊炎阳性表达为1例(2.9%),ALDH1A3在胆囊腺癌中的阳性表达率明显高于癌旁组织、胆囊腺瘤、腺瘤性息肉和慢性胆囊炎,有明显统计学差异(P<0.01)；100例人胆囊腺癌组织中GPX3阳性表达为52例(52%),46例癌旁组织阳性表达为38例(82.6%),30例腺瘤阳性表达为22例(73.3%),15例腺瘤性息肉阳性表达为13例(86.7%),35例慢性胆囊炎阳性表达为31例(88.6%),GPX3在胆囊腺癌中的阳性表达率明显低于癌旁组织、胆囊腺瘤、腺瘤性息肉和慢性胆囊炎,差异均有显著或高度显著性(P<0.05或P<0.01)；ALDH1A3阳性表达和(或)GPX3阴性表达的良性病变的胆囊上皮均呈不同程度的不典型增生。(2)肿块最大径<2cm、无淋巴结转移、未侵犯周围组织的病例中ALDH1A3表达阳性率明显低于肿块最大径≥2cm、淋巴结转移及侵犯周围组织的病例(P<0.05或P<0.01)；高分化腺癌、肿块最大径<2cm、无淋巴结转移、未侵犯周围组织的病例中GPX3表达阳性率明显高于低分化腺癌、肿块最大径≥2cm、淋巴结转移及侵犯周围组织的病例(P<0.05或P<0.01)；(3)胆囊癌病理类型、肿块最大径、有无淋巴结转移、是否侵犯肿瘤周围组织及ALDH1A3.GPX3表达水平均与患者术后平均生存时间有密切关系(P<0.05或P<0.01)；ALDH1A3表达阴性病例术后生存时间明显高于阳性表达病例(P<0.05),而GPX3表达阳性病例术后生存时间则明显高于阴性表达病(P<0.05)。表达ALDH1A3(+)GPX3(-)的患者和表达ALDH1A3(-)GPX3(+)的患者相比,生存时间显著缩短(P<0.01)；Cox回归多因素分析显示ALDH1A3表达阳性(P=0.005)或GPX3表达阴性(P=0.010)均是胆囊癌预后不良的独立评估指标。结论ALDH1A3和GPX3表达水平从相反方面反映了胆囊腺癌临床生物学行为,ALDH1A3阳性表达水平高的患者预后较差,而GPX3阳性表达水平高的患者预后较好。第四部分RNAi抑制ALDH1A3对胆囊癌GBC-SD细胞生物学行为的影响目的研究转染干扰载体pRNA-siALDH1A3前后胆囊癌GBC-SD细胞增殖能力、迁徙能力等生物学行为的变化。方法以pRNA-siNC(转染了无关序列)及未转染的胆囊癌GBC-SD细胞作对照,用Lip2000转染试剂分别将3组干扰载体pRNA-siALDH1A3-1、2和3及pRNA-siNC转染至胆囊癌GBC-SD细胞,通过荧光显微镜检测转染效率,筛选得到转染效率最高的pRNA-siALDH1A3-1干扰载体。观察转染pRNA-siALDH1A3-1前后细胞形态学的变化,并利用MTT法检测转染前后细胞增殖能力、划痕试验、transwell实验检测转染pRNA-siALDH1A3-1前后细胞迁徙能力的变化。结果1转染干扰载体pRNA-siALDH1A3及pRNAi-NC后的胆囊癌GBC-SD细胞中均可见绿色荧光表达,且pRNA-siALDH1A3-1组转染效率最高；未转染组则无荧光显示。2MTT结果显示,转染pRNA-siALDH1A3-1的胆囊癌GBC-SD细胞增殖速度从第3天至第6天均低于转染pRNAi-NC组及未转染组,有明显统计学差异(P<0.05)；转染pRNAi-NC组和未转染组的胆囊癌GBC-SD细胞增殖速度没有统计学差异(P>0.05)。3划痕后第0、48小时于100×倒置显微镜下观察,结果显示划痕后0小时转染pRNA-siALDH1A3-1、pRNAi-NC组及未转染组划痕空白区面积基本相等。48小时后,转染pRNA-siALDH1A3-1载体的细胞向划痕空白区迁移不明显,转染pRNAi-NC载体及未转染载体的胆囊癌GBC-SD细胞向划痕空白区明显迁移。4. Trans well实验显示转染pRNA-siALDH1A3-1组、转染pRNAi-NC组及未转染组穿膜细胞分别为27.5±2.38、55.4±5.43、59.8±6.23个,转染pRNA-siALDH1A3-1组的细胞穿膜数明显低于转染pRNAi-NC组及未转染组(P<0.05)。结论转染pRNA-siALDH1A3后,胆囊癌GBC-SD细胞内ALDH1A3基因表达受到明显抑制,ALDH1A3的表达沉默使胆囊癌GBC-SD细胞增殖能力减弱,迁移能力降低。